Влияние хронической нейрогенной боли на локальное содержание половых гормонов и рецепторов в коже, опухоли и перифокальной зоне у самцов с перевивной меланомой B16/F10

Стероидные гормоны играют важную роль в физиологии человека, а нарушение андрогенных, эстрогенных и прогестеронных воздействий связано с развитием различных видов как злокачественных, так и доброкачественных пролиферативных заболеваний [1]. Установлена важная роль локального синтеза половых стероидов за счет наличия ферментов CYP11A1 и CYP17A1 в периферических тканях, что дает возможность автономной регуляции пролиферативных процессов, включая доброкачественные и злокачественные опухоли [2]. Биологические эффекты половых стероидов опосредуются рецепторами. Эстрогены в основном активируют ERα и ERβ, которые являются членами надсемейства ядерных рецепторов факторов транскрипции [3, 4]. Эстрадиол (E2) является преобладающим эстрогеном у репродуктивных особей женского пола, тогда как эстрон и эстриол в основном вырабатываются во время беременности и после наступления менопаузы [5]. Хотя ERα и ERβ могут связываться с большинством эстрогенов одинаково, различия в ERα и ERβ могут приводить к привязке дифференциальных транскрипционных факторов, а затем к модуляции различных генов-мишеней. Активация ERα или ERβ может давать как уникальные, так и перекрывающиеся эффекты [6]. Прогестерон противодействует эстрогенам и стимулирует дифференцировку, что подтверждается ассоциацией генетических вариаций генов, которые кодируют рецепторы прогестерона PRA и PRB, их содержание коррелирует с повышенным риском развития рака эндометрия [7]. Прогестерон хорошо известен своим антиэстрогенным действием, наличие его рецепторов является хорошим прогностическим маркером [8], а синтез прогестерона и его метаболизм нарушаются в ткани рака эндометрия [9].

Важность андрогенов как этиологических факторов подтверждается также наличием рецептора андрогена и присутствием ферментов, метаболизирующих андроген, в хорошо и умеренно дифференцированном раке эндометрия [10]. Изучение системного и локального гормонального фона у пациенток с опухолевыми процессами позволяет признать важную роль эндокринной системы в развитии как злокачественных, так и доброкачественных опухолей [11, 12], но только экспериментальные исследования позволяют установить патогенетическое значение подобных нарушений. Ранее проводили исследования изменения гормонального статуса, как локального, так и системного, у самок мышей под влиянием хронической нейрогенной боли [13], однако, учитывая половые различия в реакции организма на болевые воздействия, представляет интерес проведение аналогичных исследований на самцах.

Целью исследования явилось изучение в эксперименте влияния хронической нейрогенной боли на локальный гормональный статус кожи, а также опухоли и окружающей ее перифокальной зоны у самцов мышей с перевивной меланомой В16/F10.

Материал и методы

Работа выполнена в осенне-весенний период на самцах мышей линии С57ВL/6 (n=52), возраст 8 нед, масса 22–23 г. Животные получены в ФГБУ Научный центр биомедицинских технологий «Андреевка» ФМБА, мышиная меланома В16/F10 – из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Исследования проводили с разрешения биоэтической комиссии при ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Мыши путём случайного отбора были распределены на группы: группа сравнения – животные со стандартной подкожной перевивкой меланомы В16/F10 (n=25), основная группа – мыши с меланомой В16/F10, растущей на фоне хронической нейрогенной боли (ХНБ) (n=27), контроль – самцы с хронической нейрогенной болью (n=8), а также интактные животные (n=8). Все манипуляции с животными осуществляли в стерильных условиях в боксе. Перевязку седалищных нервов с целью получения ХНБ и перевивку опухоли проводили по ранее отработанной методике [14]. Через 2 нед животным основной и группы сравнения подкожно вводили 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:10 по стандартной методике [14]. Интактных, контрольных животных, а также мышей из основной группы и группы сравнения через 1, 2 и 3 нед эксперимента декапитировали на гильотине. Опухоль, перифокальную зону и кожу выделяли на льду. Из тканей получали 10 % гомогенаты, приготовленные на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА, в которых с помощью стандартных тест-систем ИФА, адаптированных для экспериментальных животных, определяли уровень эстрадиола (Е2), эстрона (Е1), тестостерона (Т), прогестерона (Р4)

(CUSABIO, Китай), рецепторов эстрогенов – ERα, ERβ (Сloud-Clone Corp. США, Китай), прогестерона (RP4) и андрогенов (RA) (CUSABIO, Китай).

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета Statistica 10.0. Результаты представлены в виде M ± m, где M – арифметическое среднее значение, m – стандартная ошибка среднего. Оценка достоверности произведена с использованием критерия Краскела–Уоллиса, непараметрического U-критерия Манна–Уитни и t-критерия Стьюдента, уровень р<0,05 принимали как значимый. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты

Исследование показало (табл. 1, 2), что у самцов мышей контрольной группы под влиянием хронической нейрогенной боли по сравнению с показателями у интактных животных в коже в 1,7 раза повысился уровень Е2, но в 1,8 раза снизился Е1 на фоне роста содержания как ERα, так и ERβ – в 9,3 и в 6,5 раза соответственно (р ≤ 0,05). Кроме того, в коже самцов контрольной группы снизился уровень тестостерона в 2,7 раза, но при этом возросло содержание RA в 2,4 раза (р≤0,05). Концентрация P4 повысилась в 1,5 раза на фоне снижения уровня его рецепторов в 2,5 раза (р≤0,05). Далее в процессе исследования показатели у животных основной группы сравнивали с контролем, тогда как группу сравнения – с интактными животными (норма). Через 1 нед после перевивки меланомы у самцов мышей основной группы был отмечен «выход» опухоли, который вызвал повышение в коже в 1,7 раза уровня эстрона и снижение в 1,7 раза прогестерона (р≤0,05), содержание остальных гормонов в коже на данном этапе не изменилось. Статистически значимо по сравнению с контролем снизилось содержание всех рецепторов: ERα – в 1,7, ERβ – в 1,3, RA – в 1,26, RP4 – в 2 раза (р≤0,05). Далее на протяжении всего эксперимента в непораженной коже у мышей основной группы произошло повышение содержания прогестерона до контрольных значений, что, соответственно, превышало норму в 1,3–1,4 раза; концентрации Е2, Е1 и Т не изменились. Также в коже самцов основной группы в динамике роста меланомы не изменилось содержание рецепторов эстрогенов и андрогенов, но повысился уровень рецепторов прогестерона до показателей контроля, оставаясь ниже нормы в среднем в 2 раза.

У самцов группы сравнения в непораженной коже через 1 нед после перевивки меланомы уровень Е2 был снижен в 1,6 раза, а тестостерона – в 1,9 раза (р≤0,05), содержание Е1 и Р4 на этом этапе не отличалось от нормы. В динамике роста меланомы кожа самцов группы сравнения претерпела изменения только в отношении эстрона, содержание которого через 2 нед снизилось в 1,9 раза, по сравнению с предыдущим этапом, а затем через

3 нед повысилось в 2,4 раза, в результате превосходя показатели нормы в 1,3 раза. Кроме того, к концу эксперимента произошло снижение уровня Р4 в 1,3 раза по сравнению с нормой. Содержание рецепторов стероидных гормонов в коже в динамике роста меланомы практически не изменилось, исключение составил лишь ERβ, повысившийся через 3 нед в 2,3 раза, в результате чего нарушилось соотношение ERα/ ERβ.

Особый интерес представляет влияние хронической нейрогенной боли на гормональный баланс и рецепторный аппарат непосредственно в опухоли. У самцов основной группы в образцах меланомы по сравнению с контролем установлено повышение в первую неделю эксперимента только содержания Е1 – в 2,3 раза (р≤0,05). Далее в динамике роста меланомы уровень Е1 в опухолевой ткани животных основной группы снизился в среднем в 1,5 раза, однако оставаясь выше показателей контроля в 1,4–1,5 раза (р≤0,05). В образцах опухоли у самцов основной группы по сравнению с контролем со 2-й нед установлен рост в 1,3

Таблица 1/table 1

Содержание половых гормонов в коже, опухоли и перифокальной зоне в динамике роста меланомы В16/ F10 у самцов мышей на фоне хронической нейрогенной боли the content of sex hormones in the skin, tumor and perifocal zone in the dynamics of growth of B16/F10 melanoma in male mice with chronic neurogenic pain

Группы животных/ Groups of animals	Эстрадиол/Estradiol, нМоль/гтк	Эстрон/Estron, пМоль/гтк	Т общ/ Total T, нМоль/гтк	Р4, нМоль/гтк
Интактная/Intact	0,47 ± 0,02	202,8 ± 15,4	53,7 ± 1,4	1,02 ± 0,07
Контроль/Control	0,8 ± 0,11	112,7 ± 16,11	20,2 ± 2,81	1,5 ± 0,121
1 нед эксперимента, основная группа/Week 1 of the experiment, study group
Кожа/Skin	0,84 ± 0,05	194,2 ± 15 2	19,03 ± 1,5	0,86 ± 0,062
Опухоль/Tumor	0,83 ± 0,08	258,8 ± 242	21,8 ± 2,0	1,3 ± 0,11
Перифокальная зона/ Perifocal zone	0,79 ± 0,07	230,5 ± 23,12	22,7 ± 2,2	1,56 ± 0,15
2 нед эксперимента, основная группа/Week 2 of the experiment, study group
Кожа/Skin	0,78 ± 0,06	219,5 ± 182	20,97 ± 2,0	1,2 ± 0,12
Опухоль/Tumor	0,82 ± 0,07	158,3 ± 15,12	21,2 ± 2,1	1,59 ± 0,15
Перифокальная зона/ Perifocal zone	0,85 ± 0,08	377,2 ± 362	21 ± 2,0	1,82 ± 0,18
3 нед эксперимента, основная группа/Week 3 of the experiment, study group
Кожа/Skin	0,8 ± 0,07	178,4 ± 162	22,73 ± 2,1	1,44 ± 0,14
Опухоль/Tumor	0,8 ± 0,07	169,95 ± 15,32	21,7 ± 2,0	1,41 ± 0,14
Перифокальная зона/ Perifocal zone	0,77 ± 0,07	336,1 ± 33,22	20,3 ± 1,9	1,44 ± 0,14
1 нед эксперимента, группа сравнения/Week 1 of the experiment, control group
Кожа/Skin	0,29 ± 0,021,3	221,9 ± 17,1	28 ± 0,191,3	0,96 ± 0,05
2 нед эксперимента, группа сравнения/Week 2 of the experiment, control group
Кожа/Skin	0,3 ± 0,011,3	114,4 ± 9,81,3	27,3 ± 1,31,3	0,94 ± 0,06
Опухоль/Tumor	0,29 ± 0,011,3	417,98 ± 40,21,3	31,9 ± 1,71,3	0,95 ± 0,063
Перифокальная зона/ Perifocal zone	0,45 ± 0,023	120,4 ± 8,31,3	25,8 ± 1,61	1,16 ± 0,083
3 нед эксперимента группа сравнения/Week 3 of the experiment, control group
Кожа/Skin	0,26 ± 0,011,3	268,9 ± 16,21,3	17,1 ± 0,71,3	0,79 ± 0,041,3
Опухоль/Tumor	0,29 ± 0,011,3	417,7 ± 231,3	20,5 ± 0,51	0,37 ± 0,021,3
Перифокальная зона/ Perifocal zone	0,34 ± 0,011,3	319 ± 211	21,3 ± 2,01	0,28 ± 0,011,3

Примечание: 1 – статистически значимые отличия по сравнению с интактной кожей; 2 – статистически значимые отличия по сравнению с контролем; 3 – статистически значимые отличия по сравнению с основной группой на аналогичных сроках исследования (p<0,05).

Notes: 1 – statistically significant differences compared with intact skin; 2 – statistically significant differences compared with control; 3 – statistically significant differences compared with the study group at similar periods of the experiment (p<0.05).

раза содержания ERα и ERβ, а также повышение концентрации RP4 в среднем в 2 раза. Уровень рецепторов андрогенов в опухолевой ткани оставался высоким, как и в контроле. У самцов группы сравнения в опухоли установлен дисбаланс в содержании эстрогенов с превалированием Е1 над Е2: уровень эстрадиола в меланоме на протяжении всего эксперимента был снижен в 1,6 раза, а эстрона, напротив, повышен в 2,1 раза. Содержание тестостерона в меланоме самцов группы сравнения прогрессивно снижалось по сравнению с нормой в динамике роста опухоли: в 1,7 раза через 2 нед и в 2,6 раза через 3 нед, а уровень прогестерона упал в 2,8 раза только через 3 нед. При этом содержание рецепторов эстрогенов в опухолевых образцах превышало норму: ERα – в 7 раз и в 5,6 раза, ERβ – в 5,7 раза и в 7,3 раза – через 2 и 3 нед соответственно; RP4 в среднем в 1,7 раза, RA в среднем в 1,25 раза (р≤0,05). В результате в опухолевых образцах основной группы уровни Е2, Р4, а также ERα, ERβ и RA были выше, чем в меланоме группы сравнения, а Е1

Таблица 2/table2

Содержание рецепторов половых гормонов в коже, опухоли и перифокальной зоне в динамике роста меланомы В16/ F10 у самцов мышей на фоне хронической нейрогенной боли the content of sex hormones in the skin, tumor and perifocal zone in the dynamics of growth of B16/F10 melanoma in male mice with chronic neurogenic pain

Группы животных/ Groups of animals	ERα, нг/гтк	ERβ, нг/гтк	RP4, пг/гтк	RA, нг/гтк
Интактная/Intact	2,08 ± 0,2	2,23 ± 0,24	0,32 ± 0,03	0,28 ± 0,03
Контроль/Control	19,3 ± 1,71	14,6 ± 1,51	0,13 ± 0,021	0,68 ± 0,071
1 нед эксперимента, основная группа/Week 1 of the experiment, study group
Кожа/Skin	11,2 ± 0,82	10,9 ± 0,72	0,065 ± 0,0072	0,54 ± 0,062
Опухоль/Tumor	17,6 ± 1,8	16,9 ± 1,8	0,1 ± 0,0082	0,75 ± 0,09
Перифокальная зона/ Perifocal zone	80,7 ± 8,42	99,75 ± 10,32	0,095 ± 0,0082	0,62 ± 0,07
2 нед эксперимента, основная группа/Week 2 of the experiment, study group
Кожа/Skin	11,5 ± 1,02	10,2 ± 1,12	0,145 ± 0,02	0,61 ± 0,08
Опухоль/Tumor	24,9 ± 2,52	20,2 ± 1,92	0,28 ± 0,042	0,66 ± 0,06
Перифокальная зона/ Perifocal zone	80,7 ± 9,32	118,9 ± 12,22	0,26 ± 0,042	0,66 ± 0,09
3 нед эксперимента, основная группа/Week 3 of the experiment, study group
Кожа/Skin	9,35 ± 0,82	9,3 ± 0,82	0,16 ± 0,02	0,68 ± 0,05
Опухоль/Tumor	22,7 ± 1,6	18,78 ± 1,62	0,23 ± 0,032	0,71 ± 0,09
Перифокальная зона/ Perifocal zone	68,3 ± 5,82	78,77 ± 8,12	0,29 ± 0,032	0,72 ± 0,08
1 нед эксперимента, группа сравнения/Week 1 of the experiment, control group
Кожа/Skin	2,21 ± 0,33	2,11 ± 0,23	0,29 ± 0,033	0,26 ± 0,023
2 нед эксперимента, группа сравнения/Week 2 of the experiment, control group
Кожа/Skin	1,7 ± 0,193	1,84 ± 0,163	0,4 ± 0,053	0,29 ± 0,033
Опухоль/Tumor	14,46 ± 1,31,3	12,75 ± 1,41,3	0,55 ± 0,061,3	0,35 ± 0,043
Перифокальная зона/ Perifocal zone	1,97 ± 0,23	3,35 ± 0,41,3	0,36 ± 0,053	0,28 ± 0,033
3 нед эксперимента, группа сравнения/Week 3 of the experiment, control group
Кожа/Skin	1,85 ± 0,163	5,12 ± 0,61,3	0,35 ± 0,033	0,29 ± 0,033
Опухоль/Tumor	11,6 ± 1,21,3	16,3 ± 1,51	0,57 ± 0,071,3	0,35 ± 0,053
Перифокальная зона/ Perifocal zone	5,41 ± 0,61,3	10,8 ± 1,21,3	0,4 ± 0,063	0,35 ± 0,043

Примечание: 1 – статистически значимые отличия по сравнению с интактной кожей; 2 – статистически значимые отличия по сравнению с контролем; 3 – статистически значимые отличия по сравнению с основной группой на аналогичных сроках исследования (p<0,05).

Notes: 1 – statistically significant differences compared with intact skin; 2 – statistically significant differences compared with control; 3 – statistically significant differences compared with the study group at similar periods of the experiment (p<0.05).

и RP4 – ниже, чем у животных без хронической нейрогенной боли.

Перифокальная зона опухоли, примыкая непосредственно к злокачественным клеткам, может как ограничивать влияние злокачественного процесса, так и способствовать его распространению. Результаты исследования гормонального фона перифокальной зоны у самцов основной группы показали значимое повышение уровня эстрона на всех этапах эксперимента по сравнению с показателями контроля – через 1 нед в 2 раза, затем через 2–3 нед в среднем в 3,1 раза. Остальные исследованные гормоны оставались в пределах значений контрольной группы, то есть Е2 превышал норму в среднем в 1,7 раза, прогестерон в среднем в 1,5 раза, а тестостерон был ниже нормы в среднем в 2,5 раза. При этом содержание рецепторов эстрогенов в перифокальной зоне у самцов основной группы на всех этапах эксперимента резко превышало показатели не только нормы, но и контроля, а также опухолевые образцы: ERα в среднем в 4 раза, а ERβ в среднем в 6,8 раза по сравнению с контролем. Содержание рецепторов андрогенов на всех этапах эксперимента в перифокальной зоне в основной группе не отличалось от показателей контроля, а изначально (через 1 нед) сниженная в 1,3 раза экспрессия RP4, далее через 2–3 нед повысилась, достигнув значений нормы.

В перифокальной зоне самцов группы сравнения в динамике роста меланомы происходили поэтапные изменения, сначала через 2 нед уровень Е1 был снижен в 1,7 раза, Т – в 2,1 раза на фоне нормального содержания прогестерона и эстрадиола, однако по мере роста меланомы уровень эстрона возрос в 1,6 раза по сравнению с нормой, а эстрадиола, тестостерона и прогестерона снизился в 1,4 раза, 2,5 раза и в 3,6 раза соответственно. При этом экспрессия ERα возросла только через 3 нед в 2,6 раза, а ERβ через 2 нед в 1,5 раза, а через 3 нед в 4,8 раза по сравнению с нормой, содержание RA и RP4 статистически значимо повысилось через 3 нед в 1,25 раза (p<0,05). В результате перифокальная зона у самцов основной группы отличалась от показателей в группе сравнения более высоким содержанием эстрадиола, прогестерона, а также рецепторов эстрогенов и андрогенов, но сниженными рецепторами прогестерона.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют, что у самцов под действием ХНБ в коже наблюдается перестройка локального гормонального фона в сторону превалирования класса эстрогенов как в отношении содержания гормонов, так и их рецепторов. При этом снижение локального уровня рецепторов прогестерона можно связать с угнетением биологической значимости этого стероида, тогда как падение концентрации тестостерона на фоне роста содержания рецепторов андрогенов можно объяснить с позиции расхода, как предшественника, на локальный синтез эстрадиола. Известно, что тестостерон обладает антиноцицептивным и защитным характером, тогда как эстрогены и прогестины могут оказывать как проноцицептивное, так и антиноцицептивное воздействие, зачастую в зависимости от типа рецепторов [15].

Обращает на себя внимание дисбаланс в коже самцов контрольной группы соотношения эстрогенов с превалированием Е2 над Е1, а также соотношения ERα и ERβ с превалированием первого типа. ERα и ERβ по-разному способствуют канцерогенезу и прогрессированию опухоли: ERα в качестве онкогена и ERβ в качестве опухолевого супрессора. Однако некоторые изоформы ERβ, такие как ERβ5, могут действовать и как онкоген [16]. Согласно гипотезе «несостоятельности эстрогенов», воздействие эндогенных или экзогенных эстрогенов в отсутствие действия андрогенов и прогестинов увеличивает пролиферацию и одновременные ошибки репликации ДНК, что приводит к соматическим мутациям и злокачественным трансформациям [1, 17, 18]. Подобные изменения могут быть одним из факторов, способствующих модификации злокачественного процесса, в частности у животных с хронической нейрогенной болью.

Перевивка меланомы В16/F10 самцам основной группы повысила уровень эстрона, а также содержание рецепторов эстрогенов как α, так и β типов в образцах меланомы и наиболее выраженно в перифокальной зоне. В результате перифокальная зона меланомы у животных основной группы оказалась наиболее активной областью, характеризующейся максимальной насыщенностью ER, что на фоне низких концентраций рецепторов прогестерона могло способствовать геномной реализации биологических эффектов эстрогенов. Существует большой профиль генов, чувствительных к эстрогенам, включая pS2, катепсин D, c-fos, c-jun, c-myc, TGF-α, рецептор ретиноевой кислоты α1, efp, рецептор прогестерона (PR), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF1) [19]. Многие из этих ER-регулируемых генов, включая IGF1, cyclin D1, c-myc и efp, важны для пролиферации и выживания клеток [5]. Рецептор прогестерона может противодействовать действию ERα, ингибируя рост опухоли через взаимодействие с РНК-полимеразой III и ингибирование транскрипции тРНК [20].

Обращает на себя внимание тот факт, что как ХНБ, так и перевивка меланомы вызывают нарушение стероидного равновесия, заключающееся в снижении содержания тестостерона, на фоне роста одного из эстрогенов (Е2 в случае ХНБ и Е1 в случае В16/F10), а также провоцируют повышение концентрации рецепторов эстрогенов и андрогенов, только при болевом воздействии более выраженно, на фоне снижения уровня рецепторов прогестерона, тогда как в группе сравнения нарас- тание содержания рецепторов было постепенным, исходило из опухоли, затрагивая перифокальную зону и кожу в динамике роста меланомы.

Таким образом, одним из патогенетических факторов хронической нейрогенной боли оказалось повышение в коже уровня эстрадиола и прогестерона на фоне роста эстрогеновых и андрогеновых рецепторов и снижения содержания рецепторов прогестерона. В коже при росте меланомы повышалось содержание эстрона на фоне падения