Влияние хронической нейрогенной боли на возникновение и рост саркомы М1 в легком крыс путем изменения локального содержания факторов роста

Введение. Влияние хронической нейрогенной боли (ХНБ) на локальное содержание факторов роста в легком и возможность развития в нем злокачественного процесса практически не исследованы. Целью исследования явилось изучение уровней VEGF, TGF-β, IGF-I, IGF-II, FGF-21 и рецепторов VEGFR2, TGF-βR2 в легких белых беспородных крыс с внутривенным введением саркомы М1 на фоне хронической нейрогенной боли. Материал и методы. Эксперимент проводили на 28 белых беспородных крысах-самцах массой 200–250 г. Животные были разделены на 4 группы: 1 – ложно оперированные животные (контрольная группа) (n=7); 2 – животные с воспроизведенной хронической нейрогенной болью (n=7); 3 – ложно оперированные животные с внутривенным введением саркомы М1 (n=7); 4 – крысы с внутривенным введением саркомы М1 на фоне хронической нейрогенной боли (n=7). Животных умерщвляли декапитацией, на льду извлекали легкие, получали 10 % цитозольные фракции на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА. Методами иммуноферментного анализа (ИФА) определяли концентрацию VEGFR2, TGF-β, его рецептора TGF-βR2, IGF-I, IGF-II (CUSABIO BIOTECH Co., Ltd., Китай) и FGF21 (BioVender, Чехия). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 10.0. Результаты. Только в группе крыс с ХНБ в легких после внутривенной перевивки саркомы М1 определялись многофокусные опухолевые очаги саркомы. В легких ложно оперированных крыс после перевивки М1 опухолевые очаги не были обнаружены. В ткани легкого при росте М1 под действием ХНБ установлено снижение уровня VEGF-А, но повышение остальных TGFβ, IGF-I, IGF-II и FGF-21. ХНБ прямо или опосредованно повлияла на содержание в легком ряда факторов роста, а также изменила клеточный гомеостаз, сделав возможным возникновение опухоли после перевивки в легкое саркомы М1.

cHRoNic NeuRogeNic paiN pRoMotes deVelopMeNt aNd gRoWtH oF M1 saRcoMa cHaNgiNg local leVels oF gRoWtH FactoRs

e.M. Frantsiyants, V.a. Bandovkina, i.V. Kaplieva, l.K. trepitaki,N.d. cheryarina, i.V. Neskubina

National Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don, Russia

Ряд научных работ освещает роль факторов роста в патологических процессах в легких, однако влияние хронической нейрогенной боли (ХНБ) на локальное содержание факторов роста в легком и возможность развития в нем злокачественного процесса практически не исследованы. Эндотелиальный фактор роста (VEGF) играет важную роль в возникновении злокачественного поражения легких путем увеличения проницаемости сосудов, специфически связываясь с рецептором сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR) и активируя митогензависимые проте-инкиназы [1]. Активация различных внутриклеточных сигнальных путей может способствовать неоваскуляризации, миграции опухолевых клеток и увеличению проницаемости кровеносных сосудов. VEGF в основном продуцируется клетками в условиях гипоксии или других стрессовых состояний, особенно в тех клетках, которые экспрессируются во время роста и ремоделирования, включая опухоли. VEGF увеличивает проницаемость сосудов, индуцируя дифференцировку эндотелиальных клеток, способствуя потере целостности соединений эндотелиальных клеток и вызывая образование щелей между клетками. Этот фактор может стимулировать опухолевые сосудистые эндотелиальные клетки, индуцировать ангиогенез, улучшать проницаемость сосудов и является важным медиатором образования злокачественной опухоли в легких [2].

Было показано, что трансформирующий фактор роста (TGF-β) выполняет двойную функцию в биологии рака: ранний опухолевый супрессор и поздний опухолевый промотор [3]. На начальном этапе опухолевого процесса функция TGF-β заключается в торможении деления эпителиальных клеток и проапоптотической активности, хотя TGF-β также может способствовать и процессу пролиферации в клетках стромы. На более поздней стадии опухолевого процесса TGF-β, как полагают, стимулирует фиброз тканей, усиливает клеточную миграцию и метастазирование и нарушает иммунные и воспалительные реакции в микроокружении опухоли [4]. Цитостатические эффекты TGF-β опосредуются путем индукции белков ингибиторов циклинза-висимой киназы, таких как p15Ink4b, p21, p27, и подавлением некоторых факторов пролиферации, включая транскрипционный активатор – онкоген c-Myc [5, 6]. В силу своей разнообразной роли в управлении основными клеточными сигнальными путями передача сигналов TGF-β играет ключевую роль в развитии легких и в патогенезе легочных заболеваний [7].

Инсулиноподобные факторы роста (IGF) были впервые идентифицированы как гормоны, которые опосредуют биологические эффекты гормона роста. Накапливающиеся данные указывают на роль сигнального пути IGF не только в физиологии внутренних органов, но и при ряде заболеваний, таких как врожденные нарушения, рак, воспаление и фиброз [8]. Передача сигналов IGF модулирует развитие и дифференцировку многих типов клеток легких, включая базальные клетки дыхательных путей, клубковые клетки, альвеолярные эпителиальные клетки и фибробласты. Дефицит передачи сигналов IGF приводит к альвеолярной гиперплазии у людей и нарушению архитектуры легких на животных моделях. Компоненты сигнальных путей IGF потенцируются как биомаркеры, так как они дисрегулируются локально или системно при заболеваниях легких, однако данные могут быть противоречивыми или даже парадоксальными в различных исследованиях. Инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) и IGF-2 являются единственными членами IGF, идентифицированными до настоящего времени [8].

Фактор роста фибробластов 21 (FGF-21), специфический член суперсемейства FGF, обладает множественными метаболическими эффектами, а также способен оказывать защитный эффект при многих сердечных заболевания или патологиях, связанных с метаболизмом, таких как ишемическая атеросклеротическая болезнь сердца, ожирение и диабет [9]. Известна положительная роль FGF-21 и при патологии легких. Так, в эксперименте на животных было показано, что FGF-21 ослабляет индуцированный легочной фиброз [10]. Авторы отмечали, что FGF-21 подавлял интенсивную инфильтрацию воспалительных клеток и разрушение структуры тканей в легких, уменьшал отложение коллагена через снижение экспрессии 4-гидроксипролина в легких , а также ингибировал повышенную экспрессию TGF-β. Еще одно положительное свойство FGF-21 заключалось в проявлении способности FGF-21 ослаблять накопление внеклеточного матрикса (ECM) и индукции эпителиально-мезенхиального перехода (ЕМТ) при легочном фиброзе. Выявленные авторами положительные свойства FGF-21 имеют определенный потенциал в качестве терапевтического средства для лечения легочного фиброза [10].

Ранее нами было показано, что нарушение баланса в системе факторов роста в коже мышей линии C57BL/6 между собой и рецепторами под действием ХНБ обусловлено мобилизацией защитных механизмов, направленных на её ограничение, и формирует своеобразное метаболическое «поле», на котором «семена» – злокачественные клетки – проявляют себя агрессивно [11].

Целью исследования явилось изучение уровней VEGF, TGF-β, IGF-I, IGF-II, FGF-21 и рецепторов VEGFR2, TGF-βR2 в легких белых беспородных крыс с внутривенным введением саркомы М1 на фоне хронической нейрогенной боли.

Материал и методы

Эксперимент проводили на 28 белых беспородных крысах-самцах массой 200–250 г. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС), а также в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава России от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Протокол данного исследования был одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 4.04.2016 (протокол этического комитета № 4). Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к еде, питью и фиксированном световом режиме. В работе использовали штамм саркомы М1, полученный из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Животные были разделены на 4 группы: 1 – контрольные крысы (n=7) (ложно оперированные животные); 2 – крысы с хронической нейрогенной болью (n=7); 3 – ложно оперированные животные с внутривенным введением саркомы М1 (n=7); 4 – крысы с внутривенным введением саркомы М1 на фоне хронической нейрогенной боли (n=7).

Все манипуляции с животными производили в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицировали общепринятым способом. Хирургические манипуляции на животных производились с использованием ксила-золетилового наркоза: кси-лазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела, через 10 мин. – Золетил50 в дозе 10 мг/100 г массы тела.

Для воспроизведения ХНБ животным из 2-й и 4-й групп после наступления медикаментозного сна разрезали кожу в месте проекции седалищных нервов, накладывали на них лигатуру с двух сторон, ушивали раны. Животным 1-й и 3-й групп после наступления медикаментозного сна разрезали кожу с двух сторон в зоне проекции седалищных нервов, однако лигатуру на них не накладывали, раны ушивали (ложно оперированные животные). Через 45 дней после заживления операционных ран животным 3-й и 4-й групп в подключичную вену вводили 0,3 мл взвеси опухолевых клеток саркомы М1 в физиологическом растворе в разведении (1×106/л). На данную модель получен патент № 2676641 [12]. Животных из основной группы умерщвляли декапитацией в предтерминальном состоянии.

Крысы из группы сравнения были выведены из эксперимента на 125-е сут от момента перевивки им опухолевого материала. На льду извлекали легкие, из которых готовили 10 % цитозольные фракции на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА. Методами ИФА определяли концентрацию VEGF-А (пг/г ткани), VEGF-R1 (пг/г ткани), TGF-β (пг/г ткани), TGF-βR2 (пг/г ткани), IGF-I (пг/г ткани), IGF-II (пг/г ткани) (CUSABIO BIOTECH Co., Ltd., Китай) и FGF-21 (пг/г ткани) (BioVender, Чехия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 10.0. Полученные данные подвергали анализу на соответствие распределения признаков нормальному закону распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка (для малых выборок). Значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Данные таблиц представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала [Q1; Q3]. Различия считались достоверными при р<0,05. При статистической обработке полученных результатов соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты

Средняя продолжительность жизни крыс 4-й группы (М1 + ХНБ) составила 82,4 ± 12,4 дня. На диссекции визуализировались многофокусные опухолевые очаги в легких размером от 1 до 8 мм, бóльшая часть которых располагалась в нижней доле правого легкого и гистологически представляла собой полиморфноклеточную саркому с большим количеством фигур митоза и участками лейкоцитарной инфильтрации. При вскрытии – лёгкие слегка отёчны, опухолей нет.

Результаты по изучению содержания факторов роста в ткани легкого крыс представлены в табл. 1. Установлено, что ХНБ (группа 2) вызывала снижение содержания VEGF-A и его рецептора VEGF-R1 в легких крыс в 1,3 раза (р˂0,05) и 1,5 раза (р˂0,05) соответственно. При этом были повышены все другие изученные факторы роста. Так, содержание TGF-β1 и TGF-βR2 было выше контрольных показателей в 1,6 раза (р˂0,05) и 1,8 раза (р˂0,05) соответственно, IGF-I и IGF-II – в 1,6 раза (р˂0,05) и 3,4 раза соответственно, FGF-21 – в 2,4 раза.

В ткани легкого крыс 3-й группы (ложно оперированные), которым внутривенно были введены клетки саркомы М1 на протяжении всего эксперимента опухоль не развилась. В результате при изучении содержания всех маркеров оказалось, что в ткани легких уровни VEGF-A, VEGF-R1, TGF-βR2, IGF-I и IGF-II не имели статистически значимых отличий от значений у контрольных животных (группа 1). Уровень TGF-β1 в ткани легкого этих крыс превосходил контрольные показатели в 1,3 раза (р˂0,05), а уровень FGF-21 был повышен в 2,9 раза.

В ткани легкого крыс с развившейся опухолью на фоне ХНБ (4-я группа) отмечались более

Таблица 1/Тable 1

Уровень факторов роста в легких крыс при росте саркомы М1 в легких и на фоне хронической нейрогенной боли levels of growth factors in the lungs of rats with M1 sarcoma in the lungs in presence of chronic neurogenic pain

Факторы роста/ Growth factors	Контрольные крысы (группа 1)/ Control (group 1)	Крысы с ХНБ (группа 2)/ Rats with CNP (group 2)	Крысы с в/ввведением саркомы М1 (группа 3)/ Rats with intravenous injection of M1 sarcoma (group 3)	Крысы с в/ввведением саркомы М1+ ХНБ (группа 4)/ Rats with intravenous injection of M1 sarcoma + CNP (group 4)
VEGF-A, пг/г ткани/	1346	10061	1450,462	8191
ng/g of tissue	[1279; 1427]	[888,6; 1012]	[1347; 1584]	[756; 1201]
VEGF-R1, пг/г тка-	5,1	3,351	4,1	2,91
ни/ng/g of tissue	[2,9;5,7]	[3,2; 3,8]	[3,8; 5,1]	[2,9; 3,1]
TGF-β1, пг/г ткани/	3235,9	5310,31	4291,71	6000,51
ng/g of tissue	[2881,3; 3544,7]	[3872,8; 5361,3]	[3890; 4687,1]	[2641,9; 8294,8]
TGF-βR2, пг/г тка-	217,75	385,151	2052	239,752
ни/ng/g of tissue	[190; 241,7]	[335,75; 407,75]	[202,9; 206,5]	[233,3; 254,45]
IGF-I, пг/г ткани/	148,85	240,561	139,02	216,01
ng/g of tissue	[128,4; 160,9]	[217,2; 275,6]	[105,8; 148]	[200; 272,2]
IGF-II, пг/г ткани/	2,3	7,91	2,82	14,651,2
ng/g of tissue	[1,9; 3,5]	[6,8; 8,6]	[2,1; 3,8]	[14,3; 15,1]
FGF-21, пг/г ткани/	42,9	103,21	126,71	76,11
ng/g of tissue	[40,2; 44,1]	[82,5; 120,3]	[125,4; 140]	[55,1; 90,5]

Примечание: 1 – различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой; 2 – различия статистически значимы по сравнению с группой 2.

Notes: 1 – statistically significant compared to the control group; 2 – statistically significant compared to group 2.

существенные изменения изучаемых маркеров. Так, уровни VEGF-A и его рецептора VEGF-R1 оказались ниже контрольных значений в 1,6 раза (р˂0,05) и в 1,8 раза (р˂0,05) соответственно. Содержание TGF-β1 в ткани легкого крыс этой группы было выше контрольных показателей в 1,9 раза (р˂0,005), а рецептор TGF-βR2 не имел значимых отличий. Значимо выше контрольных показателей были значения гормонзависимых факторов роста в ткани легкого этой группы животных: IGF-I – в 1,5 раза (р˂0,05), IGF-II – в 6,4 раза, FGF-21 – в 1,8 раза (р˂0,05).

Обсуждение

В настоящее время о роли хронической нейрогенной боли в патогенезе злокачественного процесса в легких известно немного, однако существуют сведения об участии ноцицепторов дыхательной системы в управлении воспалением при различных вирусных заболеваниях, а также хронической обструктивной болезни легких [13, 14]. Ноцицепторные нейроны и иммунные клетки периферического барьера (кожа, легкие) играют ключевую роль в защите организма от опасностей окружающей среды [15]. Иннервирующие легкие ноцицепторные сенсорные нейроны обнаруживают вредные воздействия и, следовательно, защищают организмы, вызывая кашель, боль и бронхокон-стрикцию, тем самым защищая организм [16]. Литературные данные, связанные с изучением патогенетических факторов при легочных заболеваниях, весьма разрозненны. Однако имеются сведения, подтверждающие идею о том, что при различных патологиях легких, включая и злокачественные опухоли легких, изменения происходят как в сенсорной, так и в вегетативной иннервации [14]. Ряд исследователей предполагает, что одним из ключевых факторов патогенеза легочных заболеваний является нарушение взаимодействия ноцицепторов с иммунной системой, в результате угнетения которой ухудшается прогноз течения легочных заболеваний [17, 18].

В нашем исследовании была осуществлена трансплантация саркомы М1 в легкое путем внутривенного введения животным с существующей хронической нейрогенной болью, что привело к последующему возникновением опухолевого очага и его росту (группа 4), которую невозможно было осуществить ложно оперированным животным (группа 3). Полагаем, что факт приживления саркомы М1 в легком стал возможным благодаря изменившейся под влиянием ХНБ местной функциональной активности системы факторов роста. А это, в свою очередь, может свидетельствовать о снижении противоопухолевой защиты у животных под влиянием ХНБ, позволяющем осуществить приживление клеток саркомы М1 в нетипичном для них сайте. Ранее нами были выявлены особенности функционирования этой системы в коже мышей линии С57BL/6 на фоне ХНБ, способствующие увеличению злокачественного потенциала меланомы В16/F10 [11].

Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что ХНБ оказала существенное влияние на содержание факторов роста в легком, при этом наблюдалось снижение уровня VEGF-A и его рецептора 1-го типа, но повышение остальных показателей – TGF-β1 с рецептором, IGF-I, IGF-II, и FGF-21. Практически аналогичные изменения выявлены у животных группы 4, у которых на фоне ХНБ был инициирован рост саркомы М1 в легком.

Исследования in vitro подтвердили, что VEGF-A широко распространен в легочной ткани, особенно в альвеолярном эпителии, и играет важную роль в развитии и созревании легких [19]. Достаточно неожиданным оказалось снижение уровня VEGF-А при росте М1 в легком под действием ХНБ, так как известно, что рост опухоли требует генеза новых кровеносных сосудов [20, 21]. Опубликованные результаты по исследованию функции VEGF при физиологических и патологических процессах в легочной ткани достаточно противоречивы. Имеются как доказательства того, что VEGF-A может способствовать фиброгенезу [22], так и клинические данные, показывающие репаративную роль VEGF-A в легких, предполагающую протекторную функцию VEGF-A против развития чрезмерного легочного фиброза в результате повреждения легких [23]. Предполагается, что такие противоречивые результаты могут быть связаны с различными изоформами VEGF-A, и большую роль в этом могут играть хронические стрессорные воздействия [19]. Альтернативный сплайсинг экзона 8 VEGF-A приводит к образованию различных изоформ с изменением соотношения антиноцицептивной изоформы VEGF-A xxx b (выбор сайта дистального сплайсинга экзона 8b) или ноцицептивной VEGF-A xxx a (выбор проксимального сайта сплайсинга), которые могут иметь противоположные функции [24]. При этом изменения в профилях экспрессии и передачи сигналов VEGF-A сопряжены с рядом ангиогенных патологий, таких как диабет, артрит и рак, которые связаны с развитием хронической боли [24].

В доступной отечественной литературе информации о содержании факторов роста в ткани легких при различной патологии практически нет. Однако исследование факторов роста в сыворотке крови больных с хроническими обструктивными заболеваниями легких, проведенное Л.И. Афта-насом и соавт. (2018), показало снижение уровня VEGF-A, на фоне повышения TGF и FGF у больных, по сравнению со здоровыми лицами [25]. Эти исследования согласуются с результатами, полученными в нашей работе.

Можно сказать, что однонаправленное снижение уровня VEGF-A и его рецептора 1 типа при

ХНБ и росте саркомы М1 при внутривенной перевивке свидетельствует о недостаточности знаний о роли данного фактора роста, возможности его протекторного действия (по крайней мере в ткани легкого) при опухолевом росте, что может быть связано как с его ролью в синаптической передаче, так и с иммунной системой, а также с процессами клеточного старения [26–28]. В дыхательных путях ноцицепторы активно взаимодействуют с иммунными клетками, что приводит к изменению количества Т-клеток в легких, а это, в свою очередь, приводит к подавлению, в частности, защитной функции иммунитета, направленного против летальной пневмонии [16] .

Существенным отличием группы животных с ХНБ (группа 2) от внутривенного введения саркомы М1 (группа 3) оказалось отсутствие повышения уровня инсулиноподобных факторов роста в легком у последних. Известно, что передача сигналов IGF модулирует развитие и дифференцировку многих типов клеток легких, включая базальные клетки дыхательных путей, альвеолярные эпителиальные клетки и фибробласты [8]. Кроме того, IGF участвуют в канцерогенезе, подавляя апоптоз и стимулируя пролиферацию клеток, а эпидемиологические исследования показали положительную связь между циркулирующим IGF-1 и различными видами злокачественных новообразований, такими как рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак и рак простаты [29]. Предполагают, что биологические эффекты, стимулирующие злокачественный процесс в легком, регулируются IGF, который локально синтезируется мезенхимальными клетками легкого и воздействует аутокринным или паракринным способом [29]. У животных с саркомой М1 на фоне ХНБ отмечался рост содержания в легком уровня IGF-I и IGF-II, который сопровождался ростом опухоли. В отличие от этого, только внутривенное введение опухолевых клеток не способствовало росту в легком саркомы М1.

В патологических процессах легких наряду с аномальной передачей сигналов IGF участвует и TGF-β [8], рост содержания которого в легких крыс был установлен в данном исследовании при ХНБ,