Влияние in vitro электромагнитного излучения мобильного телефона на антиген-специфическую активность лимфоцитов у носителей вирусов герпес-группы

Оценка влияния физических факторов на иммунную систему остаётся актуальной задачей экологической иммунологии. Наименее изученным в этой сфере является воздействие факторов внешней среды на иммунологическую память, особенно на Т-лимфоциты памяти.

В отношении долгосрочной иммунной памяти наиболее изучены возрастные аспекты [1, 2], иммуносупрессорная терапия [3] и влияние алиментарных факторов [4, 5]. Влияние на антиген-специфические функции Т-клеток антропогенных физических факторов, в частности, неионизирующих электромагнитных полей, ставших неотъемлемой частью окружающей среды, особенно для населения, проживающего в городских условиях [6, 7], не исследовалось. Актуальность понимания роли неионизирующих электромагнитных излучений (ЭМИ) во взаимодействии инфекционного агента и иммунной системы человека постоянно возрастает [8, 9].

Сандалова С.В.* – науч. сотр.; Капустин И.В. – вед. науч. сотр., к.м.н.; Бляхер М.С. – зав. лаб., д.м.н., проф.; Котелева С.И. – вед. науч. сотр., к.м.н.; Рамазанова З.К. – вед. науч. сотр., к.м.н.; Фёдорова И.М. – вед. науч. сотр., к.м.н.; Одинцов Е.Е. – ст. науч. сотр., к.м.н. ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Тульская Е.А. – вед. науч. сотр., к.б.н. ФБУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.

Большинство вирусных инфекций приводят либо к уничтожению возбудителя, либо к смерти хозяина, поэтому их можно отнести к самоограничивающимся. Однако некоторые вирусы способны сохраняться в организме хозяина неограниченное время. По этой причине, в настоящее время, все вирусные инфекции принято дифференцировать на самоограничивающиеся и персистирующие. Для оценки влияния ЭМИ персистирующая вирусная инфекция является более адекватным и предпочтительным объектом, чем самоограничивающаяся. Во время короткого промежутка острой фазы взаимодействия инфекционного агента с иммунной системой может происходить компенсация влияния воздействий окружающей среды, в том числе и ЭМИ, за счёт резервных возможностей или дублирующих механизмов функционирования иммунной системы. При этом влияние ЭМИ будет оценено как неопределённое, слабое или недостоверное. В тоже время, при длительном течении заболевания резервных возможностей на компенсаторную реакцию может не хватить, что влечёт за собой декомпенсацию. Это обстоятельство послужило одним из критериев выбора инфекционного возбудителя как объекта для исследования воздействия ЭМИ на Т-клетки памяти.

Широко распространённой медицинской проблемой является персистенция условно патогенных вирусов. Известно, что в сохранении высокого уровня детской инфекционной заболеваемости велика роль инфекций, вызванных вирусами цитомегалии (ЦМВ), Эпштейна-Барр (ВЭБ), вирусами герпеса 1, 2, 6 и 8 типов. Влияние, которое оказывает персистирующая инфекция на иммунную систему ребёнка, часто приводит к увеличению частоты острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) [10, 11]. Более 6-8 эпизодов ОРВИ за год являются критерием отнесения пациента к группе «часто болеющих детей» или по другой терминологии «детей с рекуррентными респираторными инфекциями». При этом отмечено, что, несмотря на установленную персистенцию герпесвирусной инфекции у детей с заболеваниями верхних дыхательных путей, её специфические клинические симптомы отсутствуют в 59,2% случаев [11].

В литературе встречаются работы о состоянии Т-клеточного иммунитета при сочетанном инфицировании герпесвирусами и вирусом SARS-CоV-2, который может служить триггером перехода вируса ВЭБ от латентной фазы к фазе литической репродукции [12]. Однако в них не оценивается активность Т-клеток памяти, специфичных к разным антигенам (АГ) сопутствующей герпесвирусной инфекции.

В 2022 г. нами разработан способ оценки антиген-специфического Т-клеточного иммунитета против антигенов вируса SARS-CoV-2 [13], который при соответствующей адаптации может быть универсальным и пригодным для оценки влияния различных факторов на Т-клетки иммунной памяти против различных вирусов.

Цель работы – исследовать in vitro влияние физических факторов окружающей среды на примере ЭМИ мобильного телефона на антиген-специфическую реакцию Т-клеток иммунной памяти и адаптировать ранее запатентованный нами скрининговый способ определения специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса (SARS-CоV-2) для оценки антиген-специфиче-ского Т-клеточного иммунитета против цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр.

Материалы и методы

Соблюдение этических стандартов . Исследование одобрено Этическим комитетом ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (протокол № 3 от 31 марта 2024 г.). Законными представителями пациентов было подписано информированное согласие, включающее использование результатов исследования в научных целях без раскрытия персональной информации.

Использованное оборудование : Мобильный телефон с параметрами: SAR на тело – 1,18 Вт/кг, на голову – 1,25 Вт/кг, на телефоне подключили максимально возможное количество функций (bluetooth, wi-fi) для максимальной степени воздействия излучения от данного устройства.

Объекты исследования : Кровь и выделенные из неё лимфоциты, а также сыворотка крови 35 детей с частыми и длительными респираторными заболеваниями, обследованных на амбулаторном приёме в Клинико-диагностическом центре (КДЦ) ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

Лабораторная диагностика инфекции . IgG-антитела против ЦМВ определяли на тест-системах ЦМВ-IgG-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия). IgG-антитела против VCA и NA антигенов ВЭБ определяли на тест-системах ВектоВЭБ-VCA-IgG и ВектоВЭБ-NA-IgG (АО «Вектор-Бест», Россия). Авидность IgG-антител против ЦМВ и против VCA ВЭБ оценивали с помощью ИФА-тест-систем ВектоЦМВ-IgG-авидность и ВектоВЭБ-VCA-IgG-авидность (АО «Вектор-Бест», Россия).

Антигенная стимуляция лимфоцитов . В соответствии с запатентованным нами методом стимуляция Т-клеток памяти может проводиться антигеном, фиксированным в лунках готовых планшетов из набора для иммунферментного определения антител против данного АГ [13]. Поэтому в работе для стимуляции ЦМВ-специфических лимфоцитов использовали ЦМВ-IgG-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Россия). Для стимуляции ВЭБ-специфических лимфоцитов использовали планшеты с АГ из тест-системы ВектоВЭБ-VCA-IgG (АО «Вектор-Бест», Россия). В лунку планшета с фиксированным АГ вносили мононуклеарные клетки, содержащие 85-95% лимфоцитов, выделенные из крови обследуемого пациента (200 мкл с концентрацией 2,5-3 х 10 6 /мл). Контрольная проба каждого пациента инкубировалась в планшете без АГ.

Для изучения влияния ЭМИ мобильного телефона на АГ-специфическую активацию Т-лимфоцитов каждый образец клеток (интактный или АГ-стимулированный) делили на 2 порции. Одну порцию инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 4 ч в присутствии ЭМИ мобильного телефона, вторую – без него. Планшеты с мобильным телефоном и без него находились в разных термостатах в двух разных комнатах. На телефон проводились звонки каждые 10 мин в течение 4 ч (всего 25 звонков), динамики и вибрация были отключены. Далее инкубация при 37 ° С и 5% СО 2 продолжалась до 20 ч, после чего из лунок планшетов собирали культуральные супернатанты, которые до тестирования сохраняли при -50 ° С.

Количественная оценка уровня антигенной активации Т-клеток памяти выполнена по концентрации интерферона гамма (IFN- y ) в культуральных супернатантах, которую определяли иммуноферментным методом (тест-система ИФН-гамма-Бест (АО «Вектор-Бест», Россия)).

Статистическая обработка проводилась с использованием программ MS Excel и PRISM 8. Достоверность различий оценивалась по U-критерию Манна-Уитни. Справедливость проверяемой гипотезы исследования оценивали по величине р, критическим значением которой считали p < 0,05.

Результаты

Способность Т-лимфоцитов продуцировать IFN-y при их стимуляции этиологически значимым антигеном является одним из общепринятых показателей АГ-специфического Т-клеточного иммунитета [14, 15]. Для расширения возможностей исследований Т-клеточного иммунитета в лабораториях разного уровня оснащённости нами разработан скрининговый способ оценки анти-ген-специфического Т-клеточного иммунитета против антигенов вируса SARS-CoV-2 [13]. В настоящей работе основной принцип метода – активация лимфоцитов человека антигенами, фиксиро- ванными на планшетах для ИФА серодиагностики, – был применён для исследования АГ-специфи-ческого Т-клеточного иммунитета против антигенов ВЭБ и ЦМВ. Количественными критериями того, что Т-лимфоциты данного больного активируются при 24-часовой стимуляции АГ вируса in vitro, является увеличение в пробе количества Т-лимфоцитов с маркером активации CD69+ не менее чем на 2%, а также увеличение продукции ими IFN-γ не менее, чем на 50 пг/мл. Неспецифическое увеличение продукции IFN-γ, обусловленное активацией естественных киллерных клеток, в пробах тех же лимфоцитов составляло в среднем 9,5±2,4 пг/мл и никогда не превышало 50 пг/мл [16].

Мы обследовали 35 часто и длительно болеющих детей 4-14 лет на амбулаторном приёме в КДЦ ФБУН МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского. Среди них было 7 пациентов, которым ранее в возрасте 1-6 лет ставили диагноз «латентная ЦМВИ» или «активная ВГЧ 6 -инфекция». У них, а также у 17 других детей, были обнаружены высокоавидные IgG-антитела к ЦМВ и/или к EBVCA (табл. 1).

Медианы (Me(Q 1 ; Q 3 )) концентрации и авидности антител против ЦМВи ВЭБ-инфекции у серопозитивных пациентов

Таблица 1

Параметры	Кол-во человек в группе	Характеристика IgG-антител
		концентрация (КП, ед.)	индекс авидности (%)
IgG-антитела к ЦМВ IgG-антитела к VCA-антигену ВЭБ	n=11 n=14	3,7 (2,7; 3,9) 3,9 (3,5; 4,0)	102,0 (100,0; 106,0) 100,0 (100,0; 100,5)

Серопозитивными по ВЭБ-инфекции было 14 детей (40,0% общей выборки), по ЦМВ-ин-фекции – 11 (31,4%) человек, причём по обеим инфекциям – 8 (22,9%) пациентов. Напротив, серонегативными по обеим инфекциям были 10 человек. У 94,1% носителей в данной выборке герпесвирусная инфекция находилась в латентной фазе. У одного ребёнка методом ПЦР была установлена активная ВГЧ 6 -инфекция при отсутствии признаков активной ЦМВ- или ВЭБ-инфекции, у другого – реактивация ВЭБ-инфекции.

У всех 35 человек был исследован АГ-специфический Т-клеточный ответ разработанным нами методом. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 2. По сравнению с пробами серонегативных лиц эффект от АГ-стимуляции отчётливо выражен. Средний прирост при стимуляции антигеном ЦМВ составил Δ=(АГ-стимулированный IFN- γ – спонтанный IFN- γ )=311,2 ± 265,7 пг/мл у серопозитивных против 37,0 ± 34,0 пг/мл у серонегативных, а при стимуляции капсидным (VCA) антигеном ВЭБ прирост Δ=247,0 ± 133,4 пг/мл против 28,8 ± 28,0 пг/мл соответственно.

Таблица 2

Медианы (пг/мл, Me(Q 1 ; Q 3 )) спонтанной и АГ-стимулированной продукции IFN- γ в пробах мононуклеаров из крови обследованных детей при стимуляции антигенами вирусов Эпштейна-Барр или цитомегалии

Пациенты	Кол-во проб мононуклеаров	Антиген, применённый для стимуляции
		без антигена	антиген ЦМВ	VCA-антиген ВЭБ
Серопозитивные по ЦМВ-инфекции	n=11	15,0 (4,3; 38,8)	191,0 (111,0; 304,8)
Серопозитивные по ВЭБ-инфекции	n=14	11,0 (4,0; 35,0)		216,0 (105,0; 324,0)
Серонегативные	n=10	4,0 (2,0; 35,5)	24,0 (5,5; 54,4)	18,0 (4,0; 95,0)

В общей сложности 25 образцов мононуклеаров исходно содержали в себе Т-клетки, способные активироваться в присутствии использованных АГ. В 11 пробах были выявлены Т-лимфоциты, распознающие АГ ЦМВ, и в 14 – капсидный АГ (VCA) ВЭБ. Статистическую оценку влияния ЭМИ на АГ-активацию Т-клеток памяти проводили только для этих проб.

Влияние ЭМИ мобильного телефона изучалось при режиме облучения, которое человек, пользующийся мобильным телефоном, может получить в течение суток [17, 18]. Проведено сравнение прироста продукции (Δ=АГ-стимулированный IFN- γ – спонтанный IFN- γ ) в парных пробах мононуклеаров одного и того же пациента. Первая проба проходила АГ-стимуляцию вне воздействия ЭМИ, вторая – в присутствии ЭМИ мобильного телефона.

Наблюдаемый эффект снижения АГ-активации Т-клеток памяти in vitro под действием 4-часовой экспозиции ЭМИ мобильного телефона был значимым при р=0,028 для антигенов ЦМВ и при р=0,003 для капсидного (VCA) антигена ВЭБ (табл. 3).

Таблица 3

Медиана продукции IFN- γ (пг/мл; Me(Q 1 ; Q 3 )) АГ-специфическими Т-клетками при воздействии ЭМИ мобильного телефона на культуру мононуклеаров и без воздействия

Стимулятор	Кол-во проб клеток	Продукция IFN-γ
		без воздействия ЭМИ		под воздействием ЭМИ
		спонтанная	АГ-стимулированная	спонтанная	АГ-стимулированная
Антиген ЦМВ Антиген ВЭБ (VCA)	n=11 n=14	15,0 (4.3; 38,8) 11,0 (4,0; 35,0)	191,0 (111,0; 304,8) 216,0 (105,0; 324,0)	4,0 (2,3; 44,0) 3,0 (1,0; 7,0)	50,5 (23,5; 186,5)* 45,0 (8,0; 165,0)*

Примечание: * – значимое отличие от концентрации в пробе, не подвергшейся воздействию ЭМИ (p<0,05).

Под воздействием ЭМИ АГ-стимулированная продукция IFN- γ у разных пациентов снижалась на 21-865 пг/мл, что составляло от 14 до 100% от исходной концентрации. В табл. 4 приведены средние данные об абсолютных и относительных изменениях активности АГ-специфичес-ких Т-лимфоцитов во всех 25 пробах серопозитивных пациентов под воздействием ЭМИ мобильного телефона.

Таблица 4 Вычисление медианы (пг/мл; Me(Q 1 ; Q 3 )) для 25 проб вирус-специфических Т-клеток абсолютной и относительной количественной оценки эффекта

ЭМИ мобильного телефона

Формулы вычислений		Изменение продукции IFN-γ
		без воздействия ЭМИ Δ1	под воздействием ЭМИ Δ2
Эффект АГ-стимуляции Δ= (IFN-γ АГ – IFN-γ без АГ), пг/мл		137,5 (74,5; 301,0)	35,6 (14,9; 115,6)*
Эффект ЭМИ	Δ1–Δ2 (пг/мл) Δ1–Δ2/Δ1 (%)		73,3 (30,6; 198,9) 62,0 (42,6;87,7)

Примечание: * – отличия от Δ1 значимы при р=0,0002.

В среднем действие ЭМИ выражалось угнетением активности Т-клеток памяти in vitro , эффект ЭМИ расценивался как значимый. Тем не менее существует проблема количественной оценки результата воздействия. У некоторых пациентов воздействие может выражаться снижением параметра на 100-500 пг/мл и всё же не быть принятым как достоверное изменение. Индивидуальные изменения у пациентов приведены на рис. 1 и 2. Исходная активность АГ-специфи-ческих Т-лимфоцитов (АГ-стимулированная продукция IFN- γ ) в необлучённой пробе для каждого пациента принята за Δ1=100%, а в парной пробе под воздействием ЭМИ мобильного телефона происходило снижение или повышение этой активности: Δ1–Δ2/Δ1 (%).

Рис. 1. Индивидуальные изменения (%) активности Т-клеток памяти против антигенов ЦМВ под воздействием ЭМИ мобильного телефона (по оси абсцисс: 1 – активность вне воздействия ЭМИ, взятая за 100% (Δ1); 2 – активность при воздействии ЭМИ по отношению к Δ1). Горизонтальными линиями обозначены границы диапазона, в котором эффект от воздействия недостоверен.

Рис. 2. Индивидуальные изменения (%) активности Т-клеток памяти против антигенов ВЭБ под воздействием ЭМИ мобильного телефона (по оси абсцисс: 1 – активность вне воздействия ЭМИ взятая за 100% (Δ1); 2 – активность при воздействии ЭМИ по отношению к Δ1). Горизонтальными линиями обозначены границы диапазона, в котором эффект от воздействия недостоверен

Воспроизводимость метода, разработанного нами для определения специфического клеточного иммунного ответа на антигены коронавируса (SARS-CоV-2), характеризуется коэффициентом вариации CV=21% [16]. Данный критерий можно применить и для оценки того, какая доля проб, стимулированных антигенами герпесвирусов, оказалась чувствительной к ЭМИ мобильного телефона. Иллюстрация индивидуальных изменений (рис. 1-2) показывает, что угнетение функциональной активности вирус-специфических Т-клеток было вызвано действием ЭМИ мобильного телефона. При этом в 3 (11,1%) пробах активность Т-клеток памяти повысилась по сравнению с необлучённой пробой и в 2 пробах (7,4%) ЭМИ мобильного телефона не оказало воздействия. Две пары проб были расценены нами как нечувствительные к ЭМИ мобильного телефона.

Обсуждение результатов

Анализ изменений биологических параметров в том случае, если они не выходят за пределы референсного диапазона, наиболее развит в сфере клинической лабораторной диагностики [19, 20]. Испытательные исследования часто лишены преимуществ, которые даются обширными базами нормальных значений показателя в популяции, однако развитие подходов по количественному анализу воздействия какого-либо фактора на иммунологические параметры является продуктивным.

Так, получение данных [21] о том, что фармакологическое воздействие с разной силой стимулирует бласттрансформацию лимфоцитов в зависимости от её исходного уровня в контроле, позволило в дальнейшем провести более глубокий анализ и не просто констатировать эффект исследуемого препарата, но и выявить паттерны иммунотропного эффекта для этого препарата. Это подчёркивает необходимость более внимательной оценки свойств биологического объекта, которые ему внутренне присущи и ограничивают норму его реакции. Если функционирование исходно близко к пределу возможного, то дополнительная стимуляция либо будет незначительной, либо при сильном воздействии может приводить к патологическому срыву адаптации.

Данные примеры позволяют предположить, почему исследования влияния ЭМИ на различные параметры иммунной системы не всегда выявляют его эффект. Если выбранный параметр измеряется малыми значениями или в случайной выборке большинство объектов попадает в левую часть нормального распределения генеральной совокупности, то статистически значимое влияние ЭМИ не будет показано. В наших экспериментах внешнее воздействие вызывало снижение функциональной активности Т-клеток памяти, что наиболее демонстративно проявилось в клеточных пробах с исходно высокими значениями исследуемого параметра. При этом, если бы внешнее воздействие стимулировало активность Т-лимфоцитов, то изменения, напротив, были бы более отчётливыми при исходно низких значениях исследуемого параметра.

Заключение

Оценка функциональной активности Т-клеток иммунной памяти у серопозитивных пациентов с персистирующей инфекцией ЦМВ или ВЭБ возможна с помощью разработанного нами скринингового метода, в том числе у детей, для которых должно строго соблюдаться требование отбора как можно меньшего объёма крови. На примере ЭМИ мобильного телефона предложена количественная оценка влияния физических факторов внешней среды на лимфоциты лиц с исходно высокой и исходно низкой активностью Т-клеток памяти.