Влияние интенсивности света на развитие и содержание хлорофилла в мутантных растениях Arabidopsis с дефектами фотосинтеза

Свет является важнейшим фактором, влияющим на развитие растительного организма. У высших растений энергия света улавливается антеннами светособирающих комплексов фотосистем I и II, с которыми связаны хлорофиллы а и b. Реакционные центры фотосистемы I содержат только хлорофилл а, реакционные центры фотосистемы II — хлорофилл а и его безмагниевый аналог феофитин. Хлорофилл b входит только в состав антенн светособирающего комплекса II (Biswal et al., 2012). Эффективность работы пигментной системы зависит от соответствия ее структуры и функции климатическим и/или экологическим условиям, прежде всего условиям освещения. Тенелюбивые растения обычно имеют более высокое содержание хлорофиллов, чем светолюбивые, и более высокую долю хлорофилла b, повышающего светособирающую способность листа в области дальнего красного света (Ivanov et al., 2013). При этом фотосинтетический аппарат растений способен адаптироваться к изменениям освещенности, позволяя скоординировать распределение ресурсов для достижения и поддержания оптимальных скоростей фотосинтеза (Valladares and Niinemets, 2008) . Так, при акклимации субтропических растений семейств Araceae и Liliaceae к выращиванию в интерьере соотношение хлорофиллов а/b возрастало при снижении освещенности от 500-2500 лк до 72-124 лк у одних видов и, наоборот, снижалось у других; при этом у всех исследованных видов соотношение хлорофиллов a/b увеличивалось по мере адаптации растений к пониженной освещенности (Turbina et al., 2013). Поскольку как коровые комплексы, так и субструктуры светособирающих антенн связывают строго определенное число молекул хлорофилла, и при этом структуры фотосистемы I не содержат хлорофилла b, то соотношение хлорофиллов a/b косвенно отражает соотношение числа фотосистем I и II в тилакоидной мембране (Biswal et al., 2012) -при условии, что у растения не нарушен биосинтез хлорофиллов. Таким образом, данные об изменении содержания и соотношения хлорофиллов могут нести важную информацию о структурных перестройках фотосинтетического аппарата.

Для арабидопсиса как модельного растения известно множество разнообразных мутаций, так или иначе затрагивающих структуру и функционирование фотосинтетического аппарата. Фенотипические проявления таких мутаций очень различны: от формирования бесцветных проростков до фенотипов, внешне не отличающихся от растений дикого типа. В настоящей работе проанализированы развитие и способность к адаптации к двум уровням освещенности у ряда мутантных линий арабидопсиса, дефектных по различным компонентам фотосинтетического аппарата.

MATERIALS AND METHODS

Выращивание растений и морфометрия.

Семена Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотип Columbia-0 (далее Col-0), а также семена мутантных линий ch1-1, rtn16, psaL, и rpl35 были получены из Arabidopsis Biological Resource Center (The Ohio State University, USA). Для морфометрических измерений растения выращивали на грунте с добавлением вермикулита (размер частиц 1-2 мм) в пластиковых горшочках. Режим светового дня составлял 16 часов света, 8 часов темноты, температура 22 °С в темное время и 24 °С в светлое. Освещенность составляла 150 µmol*m-2*s-1 (умеренная освещенность) и 100 µmol*m-2*s-1 (слабая освещенность). Для определения содержания хлорофиллов растения выращивали стерильно на плотных средах следующего состава: соли MS (Sigma-Aldrich, США) – половинный состав, фитогель (Sigma-Aldrich, США) - 0,8%. После стратификации при +4 °С в течение трех суток чашки устанавливали в ростовой камере горизонтально и выращивали в тех же условиях, что и растения, выращиваемые на земле. Для морфометрических измерений брали по 5 растений из каждого горшочка на каждую точку измерения. Измерения проводили с интервалом 23 суток. Определяли цвет и количество настоящих листьев, диаметр розетки. Индексом цветения для растений, выращиваемых на земле, считали день раскрытия первого цветка в каждом горшочке.

Определение содержания хлорофиллов.

Экстракцию и измерение содержания хлорофиллов проводили согласно (Ni et al ., 2009). Навеску листьев (50 мг) гомогенизировали в жидком азоте в фаянсовых ступках, затем заливали 2 мл 80% ацетона (ЗАО Реактив, Россия), экстрагировали хлорофиллы в темноте на льду 30 минут, затем центрифугировали при +4 °С при

15000 g 15 минут (Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Германия). Супернатант разбавляли в 10 раз 80% ацетоном и измеряли оптическую плотность в диапазоне от 400 до 700 нм на спектрофотометре (УВИ-спектрофотометр СФ-56, ОКБ «Спектр», Россия). Содержание хлорофиллов a и b в экстракте рассчитывали по следующим формулам:

C a (мг/мл) = 12,7*OD 663 – 2,69*OD 645

C b (мг/мл) = 22,9*OD₆ 45 – 4,86*OD₆₆₃

Содержание хлорофиллов a и b пересчитывали на сырой вес листьев, мг хлорофилла на г сырого веса листьев.

Статистическая обработка данных.

Статистическую обработку данных и построение диаграмм проводили с помощью пакета программ Microsoft Exсel. Рассчитывали средние арифметические и стандартные отклонения. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента при уровне вероятности p < 0,05.

RESULTS

Морфометрическое исследование растений Arabidopsis thaliana линии дикого типа и мутантных линий.

В экспериментах были использованы следующие мутантные линии арабидопсиса: ch1-1– мутант по ядерному гену AT1G44446, кодирующему хлорофиллид a оксигеназу. Мутация приводит к полному отсутствию хлорофилла b и уменьшению размеров антенны светособирающего комплекса II (Yamasato et al., 2005). Растения характеризуются замедленным развитием при умеренной освещенности (Oster et al., 2000). rpl35 – мутант по ядерному гену AT2G24090, кодирующему пластидный рибосомальный белок L35. Мутация приводит к нарушению пластидной трансляции (. rtn16 – мутант по ядерному гену RTNLB16 (AT3G10915), кодирующему белок из семейства ретикулонов. Растения характеризуются желто-зеленым цветом листьев и мелкими размерами розеток при умеренной и высокой освещенности. Причинноследственная связь между мутацией и формированием такого фенотипа остается невыясненной (Tarasenko et al., 2012). psaL – мутант по ядерному гену AT4G12800, кодирующему L-субъединицу корового комплекса фотосистемы I, фенотипические отличия от растений дикого типа не описаны (Pesaresi et al., 2009).

Внешний вид растений четырех из пяти исследованных линий ( Col-0, rtn16, ch1-1, psaL ) на стадии вегетации при освещенности 150 µmol*m^-2*s^-1 представлен на рис. 1. Растения psaL практически не отличались от растений Col-0 по внешнему виду. Растения ch1-1 характеризовались значительно более светлой, зеленовато-желтой равномерной окраской листьев. У растений rtn16 наблюдали неравномерную окраску листьев (зеленые центральные жилки, остальная площадь листа желтого цвета) (рис. 1). Растения линии rpl35 отличались от растений Col-0 несколько более светлой окраской листьев (данные не представлены).

Исследовали развитие проростков линии дикого типа и мутантных линий psaL, rpl35, ch1-1 и rtn16 при освещенности 100 µmol*m^-2*s^-1 и 150

µmol*m-2*s-1. Выделяли следующие стадии развития: 1 – от прорастания до разворачивания семядольных листьев; 2 – от 1 до 2 настоящих листьев; 3 – от 3 до 4 настоящих листьев; 4 – от 5 до 7 настоящих листьев; 5 – от 8 настоящих листьев до начала цветения. Результаты представлены на рис. 2.

Для линии дикого типа при освещенности 150 µmol*m^-2*s^-1 развитие от прорастания до цветения занимало 28 суток. При освещенности 100 µmol*m^-2*s^-1 развитие замедлилось на 8 суток за счет удлинения стадий 1 и 5 (рис. 2А). Продолжительность развития растений всех мутантных линий от прорастания до начала цветения была увеличена при освещенности как 150 µmol*m^-2*s^-1, так и 100 µmol*m^-2*s^-1 по сравнению с растениями дикого типа. Наибольшее замедление развития при 150 µmol*m^-2*s^-1 по сравнению с линией дикого типа наблюдали для растений rtn16 (на 14 сут), наименьшее – у растений psaL (на 2 сут). При освещенности 100 µmol*m^-2*s^-1 наибольшее замедление развития по сравнению с растениями дикого типа наблюдали у растений ch1-1 (на 24 сут), наименьшее – у растений psaL (на 6 сут). Наиболее чувствительными к уровню освещенности оказались стадии 3 (от 3 до 4 настоящих листьев) и 5 (от 8 настоящих листьев до начала цветения): в большинстве случаев замедление развития происходило за счет именно этих стадий (рис. 2А).

Тенденция к снижению диаметра розетки при снижении освещенности наблюдалась у всех линий, кроме rtn16 (рис. 2B). Растения psaL не показали достоверных различий от растений Col-0 по данному признаку при обоих значениях освещенности. Розетки остальных трех мутантных линий - rtn16, rpl35 и ch1-1 - имели достоверно меньшие диаметры розетки по сравнению с линией дикого типа при всех условиях освещенности (рис. 2В).

Индексом цветения в данной работе считали день раскрытия первого цветка в группе растений каждой линии. У растений Col-0 цветение наступило на 28 сутки после прорастания при освещенности 150 µmol*m^-2*s^-1 и на 36 сутки при освещенности в 100 µmol*m^-2*s^-1. У всех мутантных линий цветение наступало позже, чем у Col-0 в тех же условиях: при 150 µmol*m^-2*s^-1 задержка по сравнению с Col-0 составила от 2 суток у psaL до 7 суток у ch1-1 ; при 100 µmol*m^-2*s^-1 - от 2 суток у psaL до 21 суток у ch1-1 . Для всех линий наблюдали более позднее наступление цветения при освещенности 100 µmol*m^-2*s^-1, чем при 150 µmol*m^-2*s^-1. Для растений дикого типа разница между индексом цветения при 150 µmol*m^-2*s^-1 и 100 µmol*m^-2*s^-1 составила 8 суток. Наименьшую разницу между индексом цветения при 150

µmol*m^-2*s^-1 и 100 µmol*m-2*s^-1 наблюдали у растений rtn16 (4 сут), наибольшую - у ch1-1 (22 сут) (рис. 2С).

Состав хлорофиллов в листьях растений исследуемых линий при различной освещенности.

Определяли состав и соотношение хлорофиллов у растений линий Col-0 , psaL , rtn16 и ch1-1 , выращенных при освещенности 150 µmol*m^-2*s^-1 и 100 µmol*m^-2*s^-1 (рис. 3). Ни по одному из исследованных показателей (содержание хлорофилла а , хлорофилла b , соотношение хлорофиллов а/b ) не обнаружили достоверных различий между растениями, выращенными при 150 µmol*m^-2*s^-1 и 100 µmol*m^-2*s^-1. При этом наблюдали достоверно более низкое по сравнению с растениями дикого типа содержание хлорофилла а у растений ch1-1 и rtn16 , хлорофилла b – у растений rtn16 (растения ch1-1 полностью лишены хлорофилла b ). Несмотря на различия в содержании хлорофиллов а и b , их соотношение при обоих значениях освещенности у мутантных растений psaL и rtn16 не отличалось от данного показателя у растений дикого типа (рис. 3A, 3B, 3C).

Figure 1. Внешний вид растений арабидопсиса линий Col-0, rtn16, ch1-1, psaL . Растения выращивали стерильно в чашках Петри, возраст растений – 20 суток.

ch1-1 100 pmol ~ ch1-1 150 pmol "

rpl35 100 pmol rpl35 150 pmol

rtn16 100 pmol rtn16 150 pmol _ psaL 100 pmol " psaL 150 pmol .

Col-0 100 pmol Col-0 150 pmol

■ стадия 1

■ стадия 2

■ стадия 3

■ стадия 4

■ стадия 5

в

1 - Col-0 150 pmol

2 - Col-0 100 pmol

3 - psaL 150 pmol

4 - psaL 100 pmol

5 - ch1-1 150 pmol

6 - ch1-1 100 pmol

7 - rtn16 150 pmol

8 - rtn16 100 pmol

9 - rpl35 150 pmol

10 - rp/35 100 pmol

Figure 2. (A, B, C). Морфометрические показатели для растений линии Col-0 и мутантных линий, выращенных на земле. (А) Продолжительность стадий развития растений. Стадия 1 – от прорастания до разворачивания семядольных листьев, стадия 2 – от 1 до 2 настоящих листьев, стадия 3 – от 3 до 4 настоящих листьев, стадия 4 – от 5 до 8 настоящих листьев, стадия 5 – от 9 настоящих листьев до начала цветения. Слева обозначены названия линий и уровень освещенности в µmol*m^-2*s^-1 . (B) Средний диаметр розетки растений в разном возрасте. Справа обозначены названия линий и уровень освещенности в µmol*m^-2*s^-1. Звездочкой обозначена достоверность различий с растениями линии Col-0 в том же возрасте и тех же условиях. (С) Значения индекса цветения для исследуемых линий при различной освещенности. Справа обозначены названия линий и уровень освещенности в µmol*m^-2*s^-1.

Figure 3. (A, B, C). Содержание хлорофиллов и соотношение хлорофиллов a/b в листьях растений исследованных линий при различной освещенности. (A) Содержание хлорофилла a . (B) Содержание хлорофилла b . (C) Соотношение хлорофиллов a/b . На всех диаграммах внизу обозначены названия линий и уровень освещенности. Звездочкой обозначена достоверность различий с растениями линии Col-0 в тех же условиях.

DISCUSSION

Каждая из четырех взятых в исследование мутантных линий арабидопсиса несет какой-либо дефект фотосинтетического аппарата: отсутствие L-субъединицы корового комплекса фотосистемы I у растений psaL ; отсутствие рибосомального белка, приводящее к нарушению пластидной трансляции, у rpl35 ; полное отсутствие хлорофилла b у ch1-1 ; значительное снижение содержания хлорофиллов у rtn16 . По внешнему виду наиболее яркие отличия от растений дикого типа наблюдали у растений с измененным составом хлорофиллов ( ch1-1, rtn16 ) (рис. 1). По морфометрическим показателям также выделялись ch1-1 и rtn16 . Замедление развития у растений этих двух линий по сравнению с растениями дикого типа, вероятно, можно напрямую связывать со сниженным содержанием хлорофиллов и пониженной способностью к фиксации углерода.

Интересно, что способность растений ch1-1 и rtn16 к адаптации к освещенности оказалась контрастной: для растений ch1-1 характерно сильное замедление развития и большая задержка начала цветения при понижении освещенности, тогда как для растений rtn16 , напротив, наблюдали минимальную разницу в скорости развития при 150 µmol*m^-2*s^-1 и 100 µmol*m^-2*s^-1. Мы видим для таких различий несколько взаимодополняющих объяснений.

Хлорофилл b необходим для сборки и функционирования большинства белков светособирающего комплекса II и обеспечивает его стабилизацию в тилакоидной мембране. В отсутствие хлорофилла b размер антенны уменьшается за счет деградации несвязанных с мембраной белков протеазами (Hoober and Eggink, 2001). Показано, что у растений ch1-1 отсутствие хлорофилла b приводит к дестабилизации и уменьшению размеров антенны светособирающего комплекса II (Yamasato et al., 2005), что, в свою очередь, снижает способность этих растений к фиксации углерода при слабой и умеренной освещенности. При этом повышение освещенности отчасти компенсирует уменьшенный размер антенн светособирающего комплекса II и уменьшает отставание ch1-1 в развитии от растений дикого типа (Ogawa et al., 2004). Любопытно, что небольшое (судя по отсутствию изменений в соотношении хлорофиллов у растений Col-0) снижение освещенности в наших экспериментах привело к такой значительной (22 суток) задержке цветения у растений ch1-1 по сравнению с растениями дикого типа (рис. 2С).

Для растений линии rtn16 нами были показаны ранее повышенный уровень активных форм кислорода и повышенная активность ряда антиоксидантных ферментов, причем все эти отличия от растений дикого типа были выражены у растений rtn16 тем сильнее, чем выше была освещенность. Мы пришли к выводу, что растения rtn16 на свету испытывают фотоокислительный стресс, сила которого возрастает с повышением уровня освещенности (Tarasenko et al., 2012). Вероятно, это одна из причин, по которым более высокая освещенность в наших экспериментах не приводила к значительному ускорению развития растений rnt16 (рис. 2А), а по среднему диаметру розетки различия между растениями rtn16, выращенными при 150 µmol*m-2*s-1 и 100 µmol*m-2*s-1, вовсе не наблюдали (рис. 2B). С другой стороны, хотя по суммарному содержанию хлорофиллов растения линий ch1-1 и rtn16 очень близки, соотношение хлорофиллов a/b у них резко различается: у растений rtn16 – не отличается от данного параметра у растений дикого типа, тогда как у растений ch1-1 хлорофилл b отсутствует полностью. Известно, что соотношение хлорофиллов a/b косвенно отражает соотношение числа фотосистем I и II в тилакоидной мембране (Biswal et al., 2012). В случае мутанта ch1-1 невозможно судить о соотношении числа фотосистем по содержанию хлорофиллов (при полном отсутствии хлорофилла b уменьшается размер антенн светособирающего комплекса II, но коровые комплексы фотосистемы II могут формироваться нормально), однако у растений rtn16 соотношение числа фотосистем I и II, судя по соотношению хлорофиллов, остается таким же, как у растений дикого типа. Возможно, это объясняет высокую приспособляемость к пониженной освещенности у растений rtn16.

Наши данные позволяют сделать некоторые выводы о значимости отдельных компонентов фотосинтетического аппарата для адаптации растений к уровню освещенности. Очевидно, что наибольшее влияние на характер развития растений оказало пониженное содержание хлорофиллов (линии ch1-1 и rtn16 ) и изменение соотношения хлорофиллов a/b (линия ch1-1 ).

Дефект пластидного рибосомального белка у растений линии rpl35 также приводил к замедлению развития и снижению среднего диаметра розетки во всех использованных условиях, но не приводил к существенному изменению (увеличению либо сокращению) разницы в сроках начала цветения при освещенности 150 µmol*m^-2*s^-1 и 100 µmol*m^-2*s^-1. Отсутствие L-субъединицы фотосистемы I практически не отразилось ни на одном из исследованных признаков растений линии psaL . Эта линия оказалась фенотипически наиболее близка к линии дикого типа. Предполагается, что субъединица L у высших растений, как и у водорослей, отвечает за стабильность сборки корового комплекса фотосистемы I (Ihalainen et al ., 2002). Однако отсутствие этой субъединицы, судя по нашим результатам, не является критичным для растений в условиях, близких к оптимальным.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Иркутской области (постановление № 545-пп от 29 октября 2015) грант 14-44-04001 р_сибирь_а. В работе использовано оборудование Байкальского аналитического центра (ЦКП) СО РАН при Президиуме ИНЦ СО РАН, а также оборудование ЦКП Фитотрон СИФИБР СО РАН.