Влияние интерлейкина-7 на созревание Т-лимфоцитов человека in vitro

Введение. Приоритетной задачей физиологии иммунного ответа является исследование цикла функциональных преобразований иммунокомпетентных клеток в ответ на антигенную стимуляцию под влиянием цитокинового окружения.  Интерлейкин-7 является лимфопоэтическим фактором роста,  основными клеточными мишенями которого являются Т- и В-лимфоциты, а также натуральные киллеры (Ярилин, 2010). Являясь  незаменимым фактором выживаемости наивных Т-лимфоцитов, 1L-7 поддерживает также гомеостаз антигенспецифичных Т-клеток памяти, регулирует уровни их апоптоза и гомеостатической пролиферации (Surh, Sprent, 2008). В зависимости от наличия на клеточной мембране Т-хелперных и цитотоксичесих Т-лимфоцитов молекул CD45RA и CD 197 они подразделяются на субпопуляции наивных клеток (N, CD45RA+CD197+), центральных (CM, CD45RACD197+) и эффекторных (ЕМ, CD45RACD197) клеток памяти, а также терминально-дифференцированных эффекторных клеток (TEMRA, CD45RA CD197 ), определяя гетерогенность Т-клеточного пула (Zaph et al., 2006). Дифференцировка Т-лимфоцитов, ассоциированная со степенью зрелости клеток, идет в направлении N—> СМ—> ЕМ—> TEMRA (Koch et al., 2008).

В отсутствие антигена, численность периферических Т-лимфоцитов поддерживается сложными механизмами гомеостатической пролиферации, обусловленной действием 1L-7, что относится как к наивным, так и к Т-клеткам памяти (Surh, Sprent, 2008). В присутствии антигена, в процессе его распознавания, образуется синаптическое взаимодействие между молекулами мембраны антигенпрезентирующей клетки и Т-лимфоцита. В ключевые события формирования иммунного синапса вовлечены такие структуры Т-клетки, как молекула CD3 (линейный Т-лимфоцитарный антиген), CD2 и CD28 (костимуляторные молекулы) (Ярилин, 2010). CD2/CD3/CD28 - стимуляция индуцирует запуск функциональной активности Т-клетки, на ранних этапах выражающейся в активационных процессах. Вышеописанные условия воспроизведены в эксперименте в гомеостатической и активационной моделях культивирования.

Целью настоящей работы является оценить влияние 1L-7 на дифференцировку Т-лимфоцитов, ассоциированную со степенью зрелости клеток, в гомеостатической и активационной моделях.

Методика. В исследование были включены 19 условно здоровых доноров обоих полов в возрасте от 21 до 40 лет. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности (Ficoll-Paque™, GE Healthcare, США). Позитивную селекцию CD3 клеток проводили методом колоночной магнитной сепарации (MS Columns, Miltenyi Biotech, Германия) с использованием частиц MACS MicroBeads, конъюгированных с моноклональными антителами (МКАТ) к молекуле CD3 (CD3 MicroBeads human, Miltenyi Biotech). Подсчет клеток осуществляли на автоматическом счётчике частиц (Z2 COULTER COUNTER, Beckman coulter, США). Для определения чистоты выделенной популяции клетки инкубировали с РЕ-конъюгированными МКАТ против CD3 (eBioscience, США) и анализировали на проточном цитофлюориметре BD Accuri®C6 Flow Cytometer. В эксперименте использовали клеточные культуры, содержание Т-клеток в которых составляло в среднем 99,0±0,9%.

Выделенные CD3 Т-клетки культивировали в концентрации 1,0-1,5 х 106 Кл/мл, в 24-луночных планшетах в объеме 1 мл в бессывороточной среде TexMACS (Miltenyi Biotech) с добавлением 5,0* КГ5 М 2-Меркаптоэтанола (Acros Organics, США) в течение 48 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. В эксперименте были использованы различные концентрации (0,01 нг/мл; 0,10 нг/мл; 1,00 нг/мл; 10,00 нг/мл) рекомбинантной формы 1L-7 (Human IL-7, research grade, Miltenyi Biotech). В гомеостатической модели варианты культивирования включали в себя интактную пробу (отрицательный контроль - без добавления IL-7) и пробы с добавлением диапазона концентраций 1L-7. В активационной модели культивирования использовали Т-клеточный активатор T-Cell Activation/Expansion Kit human (Miltenyi Biotech), который представляет собой антибиотиновые частицы MACSiBead™ с биотинилированными МКАТ против CD2, CD3 и CD28. Варианты культивирования в активационной модели включали в себя интактную пробу (отрицательный контроль), пробу с добавлением активатора (положительный контроль), пробы с добавлением диапазона концентраций 1L-7 и активатора.

Иммунофенотипирование CD3 лимфоцитов проводили с использованием блокатора Fc-рецепторов (Miltenyi Biotech) и коктейля МКАТ, конъюгированных с флюоресцентой меткой, приготовленного ex temporo: CD4-F1TC (eBioscience, США), CD197-PE (BioLegend, США), CD45RA-APC (BD Pharmingen, США).

Внутри общего пула Т-клеток на основании экспрессии/отсутствия экспрессии молекулы CD4 Т-клетки относили к Т-хелперным (Th, CD4 ) или цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL, CD4). Внутри популяций Th и CTL по уровню экспрессии молекул CD45RA и CD 197 клетки относили к субпопуляциям наивных клеток (N, CD45RA+CD197+), клеток центральной (CM, CD45RA CD197+) и эффекторной памяти (ЕМ, CD45RA CD197 ), а также терминальнодифференцированных эффекторных клеток (TEMRA, CD45RA+CD197" )•

Таким образом, в эксперименте анализировалось влияние диапазона концентраций IL-7 на количество Th и CTL лимфоцитов, процентный состав субпопуляций N, СМ, ЕМ и TEMRA в популяциях Th и CTL лимфоцитов.

Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения IBM SPSS Statistics v21 (Statistical Package for the Social Sciences, США). При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: медиану (Me), первый и третий квартили (25; 75). Для оценки достоверности различий выборок использовали парный критерий для зависимых выборок Вилкоксона. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение. Культивирование Т-клеток с активатором приводило к снижению числа Th ЕМ на фоне увеличения количества клеток более зрелых субпопуляций (Th TEMRA, CTL TEMRA) в сравнении с интактной пробой. Внесение диапазона концентраций IL-7 в систему активированных клеток приводило к снижению числа Th СМ при одновременном увеличении клеток более зрелых субпопуляций (Th TEMRA, CTL ЕМ) в сравнении положительным контролем (табл. 1).

Таблица 1

Количественный состав основных Т-клеточных субпопуляций в культурах

CD3 лимфоцитов в условиях инкубации с IL-7 с использованием активационной модели (Me(Qi - Q3))

Т-клсточная субпопуляция	без активатора	Т-клетки с активатором + IL-7 (нг/мл)
		0	0,01	0,10	1,00	10,00
Th	59,9 (46,4-63,1)	57,9 (48,5-62,8)	55,5 (47,4-65,5)	54,4 (43,8-66,6)	55,6 (45,2-73,2)	57,8 (46,7-71,3)
ThN	20,6 (12,1-31,6)	24,5 (17,8-43,6)	23,5 (17,9-40,1)	25,0 (19,7-45,1)	25,1 (20,1-44,7)	29,3 (26,3-42,3)
Th CM	33,5 (29,7-50,1)	38,6 (25,3-47,2)	35,5 (23,2-48,4)	29,9** (22,1-45,5)	32,0 (25,0-42,9)	30,0 (25,1-38,9)
Th EM	36,7 (28,3-48,5)	24,5* (14,3-34,5)	22,4 (16,1-42,3)	25,9 (13,8-41,3)	26,3 (14,9-43,5)	25,2 (19,0-32,4)
Th TEMRA	2,1 (1,1-4,1)	4,9* (3,4-8,9)	6,0 (3,6-11,5)	5,9 (4,7-11,5)	6,0** (5,1-10,9)	7,7 (6,7-10,8)
CTL	40,2 (36,9-53,6)	42,2 (37,3-51,6)	44,6 (34,5-52,6)	45,6 (33,5-56,2)	44,4 (26,9-54,8)	42,3 (28,7-53,3)
CTLN	46,4 (36,0-56,6)	39,1 (24,8-51,6)	31,3 (24,9-40,7)	30,2 (27,2-49,2)	35,6 (24,2-47,4)	38,5 (30,9-47,9)
CTL CM	16,6 (3,3-39,2)	12,9 (7,7-28,6)	12,0 (6,3-28,5)	10,8 (6,1-25,4)	12,7 (7,1-20,2)	10,6 (7,1-27,4)
CTL EM	22,1 (13,9-31,4)	25,0 (10,9-38,4)	31,8** (13,0-44,4)	29,0 (12,0-42,5)	32,8** (12,9-40,0)	25,4 (11,5-41,7)
CTL TEMRA	8,7 (5,5-12,1)	12,4* (9,5-20,8)	17,5 (12,6-22,0)	17,0 (10,5-24,5)	18,1 (11,7-24,3)	16,6 (14,2-20,8)

Примечание. * р<0,05 - в сравнении с T-клетками, культивированными без активирующих частиц;

** р<0,05 - в сравнении с Т-клетками, культивированными с активирующими частицами без IL-7.

Ввиду того, что субпопуляция Th СМ является менее зрелой по сравнению с Th ЕМ, истощение ее пула в ответ на действие IL-7 может определять IL-7 в качестве акселератора созревания активированных Th клеток, запуская дифференцировочный процесс в направлении Th СМ—> Th ЕМ—>Th TEMRA. При постоянстве количества Th (CD4+) клеток нарастание Th TEMRA (не способных к пролиферации) на фоне снижения Th СМ подтверждает факт IL-7 опосредованного созревания Th. Мы не обнаружили значимого изменения числа Th ЕМ, что можно объяснить одновременно идущими разнонаправленными процессами пополнения (Th CM—>Th ЕМ) и истощения пула (Th ЕМ—>Th TEMRA) этих клеток.

Таблица 2 Количественный состав основных Т-клеточных субпопуляций в культурах CD3 лимфоцитов в условиях инкубации с IL-7 с использованием гомеостатической модели (Me(Qi - Q3)

Т-клеточная субпопуляция	Т-клетки + IL-7 (нг/мл)
	0	0,01	0,10	1,00	10,00
Th	68,2 (61,8-73,1)	72,1 (61,1-75,7)	71,7 (60,0-74,5)	69,2 (58,3-75,2)	68,2 (59,2-73,3)
ThN	19,4 (10,6-24,9)	22,5 (12,5-28,4)	22,0 (11,4-28,5)	27,6 (12,5-32,2)	27,6 (12,4-29,4)
Th CM	35,2 (30,0-41,3)	27,7* (24,2-34,1)	28,1 (24,7-41,2)	37,0 (27,8-42,8)	35,9 (20,1-39,0)
Th EM	44,9 (40,9-47,8)	46,1 (41,3-51,5)	43,0 (39,1-53,5)	31,6 (29,6-51,4)	33,8 (26,9-53,7)
Th TEMRA	1,8 (0,6-4,5)	3,5 (1,2-5,5)	3,8 (1,3-6,4)	3,4 (1,3-5,9)	4,6* (3,6-12,9)
CTL	31,8 (26,9-38,2)	27,9 (24,3-39,0)	28,3 (25,5-40,0)	30,8 (24,8-41,7)	31,9 (26,7-40,9)
CTLN	41,2 (23,3-55,6)	43,2 (26,0-54,3)	44,9 (21,9-54,0)	44,8 (24,2-54,0)	41,6 (24,5-52,8)
CTL CM	8,2 (2,7-15,9)	5,6 (5,0-8,5)	6,5 (5,8-7,7)	6,0 (4,6-7,0)	5,0 (3,3-8,1)
CTL EM	37,1 (28,1-44,5)	36,6 (32,1-46,6)	37,3 (30,3-49,7)	35,4 (28,6-47,4)	34,8 (27,0-42,6)
CTL TEMRA	15,2 (11,4-17,7)	13,8 (7,8-20,8)	12,1 (8,9-17,4)	14,6 (11,2-21,1)	18,9* (15,8-24,4)

Примечание. * р<0,05 - в сравнении с Т-клетками, культивированными без IL-7.

Аппликация IL-7 в среду с активированными клетками приводила к накоплению менее зрелой субпопуляции CTL ЕМ, тогда как в положительном контроле наблюдалось накопление CTL TEMRA, что может говорить об IL-7 опосредованной дифференцировке более ранних субпопуляций до CTL ЕМ, определяя 1L-7 в качестве акселератора созревания также и активированных CTL клеток.

В гомеостатической модели культивирования (табл. 2) 1L-7 также снижал число Th СМ при повышении количества более зрелых Th TEMRA и CTL TEMRA клеток по сравнению с интактной пробой.

Наличие процесса дифференцировки клеток, ассоциированной с созреванием, в условиях отсутствия активатора говорит о роли IL-7 в качестве индуктора созревания в системе покоящихся Т-клеток. В обеих используемых моделях созревание Т-лимфоцитов начиналось со стадии клеток центральной памяти. IL-7 во всем диапазоне концентраций поддерживал численность хелперных и цитотоксических Т-лимфоцитов на постоянном уровне (табл. 1, табл. 2), что может быть связано с 1L-7 зависимыми гомеостатическими механизмами контроля пролиферации и апоптотической гибели Т-клеток.

Выводы. 1. IL-7 обеспечивает созревание хелперных и цитотоксических Т-лимфоцитов, поддерживая их численность на постоянном уровне.

• 2.    В системе покоящихся Т-клеток IL-7 выступает индуктором созревания, в системе активированных - акселератором.

• 3.    IL-7 опосредованное созревание Т-лимфоцитов обусловлено переходом Т-клеток центральной и эффекторной памяти в более поздние стадии дифференцировки.

МАЛАЩЕНКО Владимир Владимирович - аспирант Центра медицинских биотехнологий, ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университетет им. И. Канта», 236016, Калининград, ул. А. Невского, Д.14.

ГОНЧАРОВ Андрей Геннадьевич - кандидат медицинских наук, доцент, старший научный сотрудник Центра медицинских биотехнологий, ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университетет им. И. Канта», 236016, Калининград, ул. А. Невского, д.14.

МЕНЯЙЛО Максим Евгеньевич - аспирант Центра медицинских биотехнологий, ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университетет им. И. Канта», 236016, Калининград, ул. А. Невского, д.14.

Шмаров В.АА. Влияние интерлейкина-7 на созревание Т-лимфоцитов человека in vitro / В.А. Шмаров, В.В, Малащенко, А.Г. Гончаров, М.Е. Меняйло // Вести. ТвГУ. Сер.: Биология и экология. 2016. № 4. С. 75-81.