Влияние интервала времени между воздействием излучений разного качества на выживаемость клеток мышиной меланомы В-16

Конкуренция в сфере разработки новых медицинских технологий, интенсивное внедрение методов ионной терапии, а также побочные негативные эффекты, наблюдавшиеся при лечении быстрыми нейтронами в 70-е годы прошлого столетия, привели к ограничению использования нейтронов и, как следствие, утрате возможностей реализации преимуществ нейтронной терапии в медицинской практике в целом [1]. В России дистанционная нейтронная терапия осуществляется в двух центрах: НИИ онкологии СО РАМН (Томск) и Уральском центре нейтронной терапии (Снежинск). В МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России (Обнинск) нейтронная терапия не проводится с 2002 г., с момента выведения из эксплуатации реактора БР-10 (АО «ГНЦ РФ – ФЭИ», Обнинск). Вместе с тем, исследования биологических эффектов нейтронов с использованием портативных нейтронных генераторов с энергией ~14 МэВ (ИНГ-031, НГ-14, НГ-24), разработанных во ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова (Москва) продолжаются как в опытах in vitro , так и in vivo [2-6].

Исаева Е.В. – с.н.с., к.вет.н.; Бекетов Е.Е.* – зав. лаб., к.б.н.; Наседкина Н.В. – лаб.-иссл.; Малахов Е.П. – м.н.с.; Трошина М.В. – н.с.; Лычагин А.А . – зав. лаб., к.ф.-м.н.; Ульяненко Л.Н. – в.н.с., д.б.н., проф.; Ульяненко С.Е. – зав. отделом, д.б.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

Современные тенденции использования быстрых нейтронов в лучевой терапии заключаются в отказе от их самостоятельного применения [1, 7]. Вместо этого используют схемы сочетанного гамма-нейтронного воздействия, в которых вклад нейтронов в суммарную очаговую дозу колеблется от 20 до 40%. Теоретическим обоснованием сочетанного применения редко- и плотноионизирующего излучений является предположение [8], из которого следует, что излучения с высокой и низкой линейной передачей энергии (ЛПЭ) не действуют независимо друг от друга, а существует взаимодействие между двумя типами излучений. Характер этого взаимодействия может зависеть как от вклада плотноионизирующего компонента в суммарную дозу облучения, так и от последовательности применения излучений и временного интервала между воздействиями.

В проведённых ранее исследованиях нами было показано, что при одновременном облучении клеток мышиной меланомы В-16 γ-квантами 60Со и нейтронами с энергией 14,1 МэВ (с вкладом последних 15, 20 и 30% по физической дозе) по тесту клоногенной активности клеток наблюдался синергетический эффект [2, 9]. Целью данной работы являлось исследование влияния длительности временного интервала между облучениями нейтронами и γ-квантами в разной последовательности на сохранение эффекта синергетического взаимодействия.

Материалы и методы

Клеточная линия. В качестве экспериментальной тест-системы использовали культуру клеток мышиной меланомы В-16F10. Культуру клеток получили из ГУЗ «Московский НИИ медицинской экологии», выращивали в монослое в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см² (Corning, США) в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) и гентамицина (ПанЭко, Россия) из расчёта 0,01 мг/мл среды. Клетки культивировали в СО 2 -инкубаторе (MCO-5AC, Sanyo, Япония) при температуре +37 °С и 5% содержании СО 2 . Характеристика клеточной линии приведена в ранее опубликованной работе авторов [10].

Анализ клоногенной активности. Клетки облучали в монослое в чашках Петри диаметром 3,5 см (Corning, США). После облучения определяли их клоногенную активность. Клетки снимали с пластика смесью растворов версена (0,02%) и трипсина (0,25%) в соотношении 1:1, ресуспендировали в среде RPMI-1640 до получения одиночных клеток и подсчитывали в камере Горяева. Облучённые и интактные (без облучения) клетки высевали в чашки Петри диаметром 100 мм (Corning, США) в среду RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. На одну чашку высевали по 10000 клеток, подвергшихся облучению, и по 1000 – без облучения. Чашки с клетками выдерживали в СО 2 -инкубаторе в течение 8-9 суток до формирования видимых невооружённым глазом колоний. По окончании инкубации культуральную среду удаляли, колонии окрашивали 2% раствором метиленового синего в 50% этаноле. Подсчёт вели на ручном счётчике Interscience Scan 100 (Франция), учитывая колонии, содержащие 50 и более клеток. Фракцию клоногенных клеток выражали в процентах по отношению к высеянным. Итоговая выживаемость представляла собой отношение выживаемости в экспериментальной и контрольной группах.

Процедура облучения. Источником нейтронного излучения служил портативный генератор нейтронов НГ-14 непрерывного действия, разработанный во ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова, Москва. Генератор позволяет получить практически моноэнергетические (7%) ней- троны с энергией, зависящей от угла вылета и энергии дейтронов (при угле вылета 90° независимо от энергии дейтронов - 14,1 МэВ) с интенсивностью до 1,5-1010 н/с. В качестве источника гамма-излучения (60Co) использовали установку «Луч» (Е=1,25 МэВ). Схема опыта включала два варианта облучения клеток в разной последовательности: сначала гамма-излучение, затем нейтронное (g-n), и наоборот – сначала нейтронное, затем гамма-излучение (n-g) с интервалами 30, 60 и 120 минут между воздействиями. В интервале между облучениями клетки находились в СО2-инкубаторе. Доза гамма-излучения составляла 4,5 Гр, мощность дозы ~1 Гр/мин; доза нейтронного излучения ~ 1,0 Гр, мощность дозы ~ 0,3 Гр/мин. Исследования проводили в трёх повторностях для каждого варианта опыта.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения R ( версии 3.4.1 с применением пакета "multcomp". Сравнение выживаемости клеток в разных вариантах опыта – с применением дисперсионного анализа и критерия Тьюки. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований влияния длительности временного интервала между нейтронным и гамма-облучением в разной последовательности на клоногенную активность клеток меланомы В-16 свидетельствуют об эффекте взаимодействия повреждений, индуцированных разными видами излучения (рис. 1). Даже после двухчасового интервала между облучениями выживаемость клеток меланомы (~ 3%) была значительно ниже выживаемости, которую мы наблюдали при независимом действии двух агентов в тех же дозах (8-10%) в ранее опубликованном исследований [2]. Данный эффект может объясняться с позиций синергизма [8, 11]. Временной интервал между воздействием редко- и плотноионизирующего излучений может оказывать влияние на уровень клоногенной активности облучённых клеток. Увеличение интервала между облучениями от 30 до 120 минут сопровождалось повышением количества выживших клеток примерно в два раза (с 1,5 до 3,0%). Экстраполяция данных позволяет рассчитать выживаемость при отсутствии интервала между воздействием, которая составляет около 1%. Статистически значимое различие по критерию Тьюки отмечено для вариантов опыта с интервалами между облучениями 30 и 120 минут независимо от последовательности воздействия нейтронов или фотонов.

Интервал между облучениями, мин

Рис. 1. Выживаемость клеток меланомы B-16 (по данным клоногенной активности, средние значения и стандартные отклонения) в зависимости от интервала между облучениями: левый столбик – сначала облучение нейтронами затем фотонами (n-g), правый – фотонами, затем нейтронами (g-n).

Следовательно, как в случае первоначального воздействия фракции нейтронов (плот-ноионизирующее излучение), так и в случае первоначального воздействия фотонами (редкоио-низирующее излучение) имеется некоторый пул клеток, способных к восстановлению при наличии определённого временного интервала до следующей фракции (другого типа воздействия) и физиологических условий содержания клеток между облучениями (+37 ^оС, содержание 5% СО 2 ). Исходя из характера дозовых зависимостей обоих типов излучений (линейная для нейтронов и линейно-квадратичная для фотонов [2, 5]), следовало ожидать, что после облучения фотонами будет наблюдаться более выраженный рост выживаемости клеток с увеличением интервала между облучениями, в то же время наши данные не подтвердили это. При облучении нейтронами формируется достаточное количество сублетальных повреждений ДНК, которые после облучения фотонами становятся летальными для клетки. Можно предположить, что это связано с характером вторичных ионизирующих частиц, образующихся после облучения нейтронами с энергией 14,1 МэВ. В условиях протонного равновесия ~70% поглощённой дозы нейтронов обусловлено протонами и 30% – α-частицами и ядрами отдачи более тяжёлых элементов ткани C, N, O [12]. Таким образом, именно редкоионизирующий компонент вторичного излучения нейтронов с энергией 14,1 МэВ обеспечивает как взаимодействие повреждений, наносимых двумя видами излучений, так и их восстановление.

В основу современных представлений о механизмах синергетического действия двух агентов ионизирующей природы на клетку положены два предположения: они изменяют качество повреждений при сочетанном действии, приводя к формированию сложных кластерных повреждений, и/или влияют на клеточные механизмы восстановления этих повреждений. В пользу обеих точек зрения свидетельствуют результаты исследования Staaf и соавт. [13] о формировании гамма-фокусов в клетках, подвергнутых облучению смешанным пучком альфа-частиц и рентгеновских лучей. Авторами была выдвинута гипотеза, что наличие повреждений, вызванных рентгеновским излучением, изменяет механизм репарации ДНК и приводит к отсроченному ответу на более сложное повреждение, вызванное альфа-частицами. Позднее Sollazzo и соавт. [14] предположили, что повреждение ДНК, вызванное излучением с высокой ЛПЭ, приводит к изменению структуры хроматина, что делает ДНК более восприимчивой к воздействию активных форм кислорода, генерируемых излучением с низкой ЛПЭ. Cary и соавт. [15] и Zhang и со-авт. [16] показали, что гамма-нейтронное облучение усиливает экспрессию некоторых генов, в частности, фактора роста тромбоцитов (PDGF) и ангиопоэтина 2 (ANG2).

В отношении последовательного применения двух излучений разного качества и эффективности той или иной последовательности, опубликованные в литературе данные противоречивы. Их результаты зависят не только от характеристик излучений, но и изучаемых биологических систем. Некоторым доказательством большей эффективности режима, при котором фракция редкоионизирующего излучения предшествует облучению нейтронами, могут служить результаты облучения рентгеновскими лучами и ионами неона [17]. Меньшая эффективность режима облучения «n-g» по сравнению с обратной последовательностью («g-n») выявлена при действии нейтронов с энергией 3 МэВ на кожные покровы мышей [18]. Аналогичный вывод о большей эффективности режима «g-n» получен отечественными исследователями на проростках и покоящихся семенах Crepis Capillaris [19] и на дрожжах с использованием реакторных нейтронов [20].

О большей биологической эффективности облучения при предварительном нейтронном воздействии с последующим гамма-облучением («n-g») свидетельствуют многочисленные данные. С помощью метода ДНК-комет в исследованиях на лимфоцитах [21] показано, что предварительное облучение приводило к выраженному адаптивному ответу как в случае редкоионизи-рующего излучения (γ-γ), так и плотноионизирующего излучения 252Cf (n-n). Облучение в режиме γ-n также приводило к достоверному снижению эффективности облучения. Использование нейтронов в брахитерапии показало другой возможный механизм большей эффективности последовательности «n-g» [22]: идущая сначала фракция нейтронов 252Cf приводит к гибели гипоксических клеток, что провоцирует последующую реоксигенацию соседних клеток и уже через 5-6 суток после воздействия клетки опухоли оказываются более радиочувствительными к γ-излучению.

Кроме вывода о большей эффективности той или иной последовательности применения плотно- и редкоионизирующих излучений имеются данные и об отсутствии каких-либо различий при облучении сочетанным гамма-нейтронным излучением клеток китайского хомячка линии V79 [23-25]. Однако, в отличие от фундаментальных исследований in vitro , кроме противоопухолевого действия, в лучевой терапии решающую роль играет и действие излучения по отношению к здоровым тканям. С учётом того, что в здоровых и опухолевых клетках репаративные процессы выражены в разной степени, возможен подбор режима, который будет оказывать разнонаправленное действие в отношении опухолевых и нормальных клеток. Так, в исследованиях in vivo было показано, что фракционирование гамма-нейтронного излучения в режиме «g-g-n-n» по сравнению с обратной последовательностью обеспечивает как менее выраженные кожные реакций, так и повышение числа полностью излеченных животных [26].

Заключение

На основании полученных в рамках настоящего исследования экспериментальных данных на клетках меланомы В-16 можно сделать заключение о независимости эффективности сочетанного воздействия нейтронов портативного генератора НГ-14 (14,1 МэВ) и фотонов (60Со, 1,25 МэВ) от последовательности их применения. Это достаточно неожиданно ввиду большой разницы в ЛПЭ этих излучений и отличается от результатов ряда исследований о наличии зависимости развития поражения от последовательности применения излучений разного качества. Выживаемость клеток меланомы В-16 даже после двухчасового интервала между облучениями находится ниже уровня, ожидаемого, исходя из предположения о независимом действии нейтронов и фотонов, таким образом, эффект синергизма сохраняется в течение этого времени. Увеличение интервала между воздействиями нейтронов и фотонов, независимо от их последовательности («n-g», «g-n»), позволяет клеткам запускать и успешно реализовывать механизмы восстановления повреждений ДНК. Наиболее приемлемым, с точки зрения практической реализации результатов исследования, является интервал между облучениями фотонами и нейтронами независимо от их последовательности не более 1 ч. Однако данный вывод касается только противоопухолевой эффективности и не распространяется на действие такого сочетанного воздействия на здоровые ткани.

Данная работа проводилась в рамках выполнения тем государственного задания МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России за 2015-2017 гг. [27].