Влияние интраоперационной аппликации циклоспорина а на регенерацию тканей переднего отрезка глаза при экспериментально индуцированной глаукоме

• ¹ В ведение. В основе регенерации тканей лежит процесс увеличения числа клеток путем их деления, однако при различных заболеваниях нормальное развитие данного многофакторного процесса нарушается, что ведет к нарушениям функций соответствующего органа. Чрезмерная регенерация тканей глаза при патологии органа зрения, несмотря на внедрение новых методов медикаментозной коррекции, микрохирургических и лазерных технологий лечения, нередко является причиной слепоты и слабовидения.

Современный арсенал лекарственных средств, используемых в офтальмохирургии, в частности, для профилактики рубцевания искусственно созданных в ходе антиглаукомных операций путей оттока внутриглазной жидкости, представлен препаратами различных фармакологических групп, воздействующих на конкретные звенья фиброгенеза (5-фторурацил, Митомицин С) [1–5]. Однако широкое использование данных цитостатиков ограничено в связи с высоким риском развития таких осложнений, как цилиохорио-идальная отслойка, несостоятельность послеоперационных швов, гипотония глазного яблока, прогрессирование катаракты [6, 7].

Очевидно, что прогресс в лечении и профилактике избыточной регенерации тканей при патологии переднего и заднего отрезка глаза связан с разработкой новых эффективных методов на основе углубленного изучения патогенетических механизмов пролиферативного синдрома [8–10].

Цель: в эксперименте in vivo изучить особенности регенерации конъюнктивы и склеры глазного яблока после операции с аппликацией 0,05% раствора Циклоспорина А на фоне экспериментально индуцированной глаукомы.

Материал и методы. Исследование выполнено на базе лаборатории биологических моделей (руководитель — к.б.н. В. В. Иванов) ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Протокол проведения

эксперимента утвержден локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России от 16.11.2015 г. №4346. Эксперимент выполнен на 29 кроликах-самцах калифорнийской породы (29 глаз). На I этапе эксперимента всем животным воспроизводили стероидную модель глаукомы с помощью субконъюнктивального введения 0,5 мл 0,4% раствора (р-ра) Дексаметазона в оба глаза с интервалом 1 раз в 7 дней на протяжении трех месяцев (12 инъекций). Уровень внутриглазного давления (ВГД) у кроликов измеряли с помощью тонометра Маклакова массой 10 г 1 раз в 7 дней. Через 2 недели после выполнения 12-й субконъюнктивальной инъекции 0,4% р-ра Дексаметазона из эксперимента вывели 5 животных с последующей энуклеацией глазных яблок.

На II этапе эксперимента, через 4 недели после выполнения последней субконъюнктивальной инъекции 0,4% р-ра Дексаметазона, всем животным (24 кролика калифорнийской породы) с экспериментально индуцированной глаукомой в условиях операционной под общей анестезией в верхнем отделе одного из глаз вблизи лимба выполняли сквозной разрез конъюнктивы глазного яблока и несквозной надрез поверхностных слоев склеры. В зависимости от хода операции животные были разделены на две группы: основную группу (16 кроликов) и группу сравнения (8 кроликов). Кроликам основной группы на зону вмешательства накладывали гемостатическую губку, пропитанную 0,05% р-ром Циклоспорина А. В зависимости от продолжительности интраоперационной аппликации цитостатика животные основной группы были разделены на две подгруппы: подгруппа «а» (8 кроликов) — длительность аппликации антиметаболита составляла 3 мин; подгруппа «b» (8 кроликов) — длительность аппликации составляла 6 мин. Кроликам группы сравнения (8 животных) на зону хирургического вмешательства на 3 мин накладывали гемостатическую губку без цитостатика. По окончании аппликации гемостатическую губку у животных всех трех групп убирали, закапывали р-р Тобрамицина, на конъюнктиву глаза накладывали два узловых шва нитью из капрона. В послеоперационном периоде всем животным в конъюнктивальную полость оперированного глаза закапывали р-р Тобрамицина 3 раза в день.

На 4, 10, 14, 21-е сутки после оперативного вмешательства из эксперимента выводили по два животных из каждой подгруппы основной группы и группы сравнения, выполняли энуклеацию глазных яблок. Забой экспериментальных животных осуществляли с соблюдением правил и норм Европейского общества (86/609ЕЕС) и Хельсинкской декларации. Полученный материал фиксировали с последующей окраской гематоксилином и эозином и по методу Маллори для световой микроскопии под 100- и 200-кратным увеличением. С помощью цифровой фотокамеры Canon Power Shot G10 производили съемку 10 случайных полей зрения для каждого среза, с использованием программы ImageJ 1.46 и плагина «Cell Counter» подсчитывали абсолютное и относительное содержание клеток в конъюнктиве и склере глаз кроликов в области операции. Статистический анализ результатов проводили с использованием статистического пакета IBM SPSS Statistics 20. Нормальность распределения показателей проверяли с помощью закона Колмогорова — Смирнова. Результаты представлены в виде M±m, где M — выборочное среднее, m — ошибка среднего. В связи с несоответствием распределения данных нормальному закону распределения использовали непараметрический U-критерий Манна — Уитни. Статистически значимыми различия считали при уровне значимости р<0,05.

Результаты. Исходный уровень ВГД у кроликов составлял 13±4 мм рт.ст., что соответствует норме у животных данного вида. После развития стероидной модели глаукомы у всех кроликов к концу 3-го месяца эксперимента, после 12 инъекций 0,4% р-ра Дексаметазона, средний уровень ВГД составил 47±3 мм рт.ст., что в 3,6 раза превышало исходный нормальный уровень.

При офтальмоскопии у всех животных (29 кроликов) в ходе эксперимента отмечалось постепенное формирование глаукомной экскавации диска зрительного нерва (ДЗН) в виде расширения и углубления физиологической экскавации. По данным световой микроскопии, у животных (5 кроликов) в конъюнктиве глазных яблок обнаруживались выраженный фиброз стромы со сдавлением и облитерацией сосудов, выраженное расширение и переполнение лимфатических сосудов. В склере отмечались дистрофические изменения в виде чередования участков истончения и уплотнения стромы. В дренажной зоне угла передней камеры наблюдалось уплотнение трабекулярных пластин с зонами обнажения коллагенового остова и отложением пигмента в межтрабекулярных щелях. На отдельных участках коллагенового остова трабекул обнаруживались плотные конгломераты, в которых не дифференцировались межтрабекулярные пространства и границы между трабекулами. Сходная патоморфологиче-ская картина наблюдалась и в шлеммовом канале, просвет которого был неравномерным по ширине — от участков полной облитерации до зон локальной эктазии.

Патологические изменения, выявленные в ходе офтальмоскопии и при световой микроскопии срезов склеры, структур угла передней камеры глазных яблок кроликов при воспроизведении в эксперименте in vivo стероидной модели глаукомы, соответствуют таковым при естественном развитии и прогрессиро- вании глаукомного процесса. Это свидетельствует об адекватности выбранной модели заболевания.

В ходе II этапа эксперимента по данным световой микроскопии на 4-е сутки после операции в подгруппе «а» основной группы (8 кроликов) в зоне 3-минутной аппликации р-ра Циклоспорина А в конъюнктиве глазного яблока обнаруживались локальные участки деструкции эпителия, субэпителиально — отек и фрагментация коллагеновых волокон. В склере коллагеновые волокна располагались рыхло. В клеточном составе в области операции преобладали мононуклеарные лейкоциты (МНЛ) 819,7±54,0 (54%) клеток в 1 мм2 среза. Численность фибробластов (ФБ) и полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЛ) составляла 516,1±57,0 (34%) и 182,2±24,0 (12%) клеток в 1 мм2 среза соответственно.

В подгруппе «b» основной группы (8 кроликов) на 4-е сутки после операции в области вмешательства с 6-минутной аппликацией антиметаболита наблюдались выраженная деструкция эпителия конъюнктивы глазного яблока, диффузный субэпителиальный отек, значительная фрагментация коллагеновых волокон. В склере обнаруживались участки деструкции коллагеновых волокон. В клеточном составе преобладали МНЛ 282,6±51,0 (59%) клеток в 1 мм2 среза. Число ПМЛ и ФБ составляло 52,7±4,0 (11%) и 143,7±22,0 (30%) клеток в 1 мм2среза соответственно. Плотность ФБ была в 3,6 раза ниже, чем в подгруппе «а» основной группы (p<0,05).

В группе сравнения (8 кроликов) эпителий конъюнктивы глазного яблока в зоне операции был истончен и уплощен, в склере наблюдались отек и расслоение пучков коллагеновых волокон. Среди клеток преобладали МНЛ 1960,8±236,0 (47%) клеток в 1 мм2 среза, численность ПМЛ составляла 375,5±15,0 (9%). Плотность ФБ была 1835,7±218,0 (44%) клеток в 1 мм2, что в 12,8 раза превышало данный показатель у кроликов подгруппы «b» основной группы (p<0,05) и в 3,6 раза у кроликов подгруппы «а» (p<0,05).

На 10-е сутки после операции в подгруппе «а» основной группы (6 кроликов) в области 3-минутной аппликации р-ра Циклоспорина А сохранялось истончение конъюнктивы, однако начиналась эпите-лизация локальных дефектов конъюнктивы за счет многослойного плоского эпителия. В склере сохранялось расслоение пучков коллагеновых волокон. В клеточном составе в области вмешательства наблюдалось существенное — в 1,8 раза увеличение численности ФБ до 948,4±49,0 (68%) клеток в 1 мм2 по сравнению с уровнем на 4-е сутки (р<0,05). Число ПМЛ и МНЛ снизилось в 8,9 и в 2 раза (р<0,05), составив 20,5±4,0 (2%) и 417,1±36,0 (30%) клеток в 1 мм2 соответственно.

В подгруппе «b» основной группы (6 кроликов) на 10-е сутки после операции поверхностный слой конъюнктивы глазного яблока в области вмешательства с 6-минутной аппликацией р-ра цитостатика был представлен многослойным плоским эпителием, коллагеновые волокна склеры были фрагментированы и располагались рыхло. Среди клеток в области хирургического вмешательства преобладали ФБ — 778,7±35,0 (68%) клеток в 1 мм2, что в 5,4 раза превышало показатель в данной подгруппе на 4-е сутки (р<0,05), однако в 1,2 раза было меньше показателя в подгруппе «а» основной группы на 10-е сутки. Численность ПМЛ по сравнению с уровнем 4-х суток снизилась в 2,2 раза, составив 24,0±3,0 (2%) (р<0,05). Плотность МНЛ увеличилась в 1,2 раза, составив 340,3±17,0 (30%) клеток в 1 мм2.

В группе сравнения (6 кроликов) на 10-е сутки после хирургического вмешательства конъюнктива глазного яблока в области операции имела нормальное строение. Пучки коллагеновых волокон склеры были толстыми и плотно расположенными друг к другу. В клеточном составе преобладали ФБ — 3173,6+149,0 (80%) клеток в 1 мм 2 среза, что в 1,7 раза (p<0,05) превышало таковой показатель на 4-е сутки после операции. При сравнении с показателями у животных основной группы численность ФБ в группе сравнения на 10-е сутки превышала таковой уровень в подгруппе «а» в 3,3 раза и в подгруппе «b» в 4,1 раза (р<0,05). При сравнении плотности ФБ в группе сравнения на 10-е сутки с показателями основной группы на 4-е сутки после операции, в подгруппе «а» плотность ФБ была ниже в 6,2 раза, в подгруппе «b» ниже в 22,1 раза (р<0,05). Численность ПМЛ и МНЛ на 10-е сутки после операции в группе сравнения составляла 158,7+8,0 (4%) и 634,7+31,0 (16%) клеток в 1 мм 2 , что в 2,4 раза и в 3,1 раза (р<0,05) было меньше соответствующих показателей на 4-е сутки.

На 14-е сутки после операции в подгруппе «а» основной группы (4 кролика) в области вмешательства с 3-минутной аппликацией р-ра Циклоспорина А в конъюнктиве сохранялись локальные зоны истончения поверхностных слоев конъюнктивы, незначительный субэпителиальный отек. В склере пучки коллагеновых волокон были расслоены. Численность ФБ составляла 1311,0+124,0 (70%) клеток в 1 мм² , , что превысило уровень данных клеток на 4-е сутки в 2,5 раза (р<0,05) и в 1,4 раза превышало показатель 10-х суток (р<0,05). Плотность МНЛ составляла 492,4+20,0 (26%) клеток в 1 мм² (р<0,05). Численность же ПМЛ увеличилась в 4,1 раза по сравнению с 10-ми сутками, составив 83,6+5,0 (4%) (р<0,05).

В подгруппе «b» основной группы (4 кролика) на 14-е сутки после операции поверхностный слой конъюнктивы был представлен многослойным плоским эпителием, субэпителиально обнаруживался незначительный отек. В склере сохранялась фрагментация пучков коллагеновых волокон. В клеточном составе преобладали ФБ — 866,5+44,0 (65%) клеток в 1 мм2, что статистически значимо не отличалось от уровня 10-х суток, однако в 1,5 раза превышало данный показатель подгруппы «а» на 14-е сутки (p<0,05). Численность МНЛ составила 413,4+32,0 (31%) клеток в 1 мм2 (p<0,05). Плотность ПМЛ увеличилась в 2,2 раза — 53,1+2,0 (4%) (р<0,05).

В группе сравнения (4 кролика) конъюнктива глазного яблока в области операции имела нормальное строение, пучки коллагеновых волокон склеры располагались плотно друг к другу. При этом в зоне хирургического вмешательства конъюнктива глаза была плотно сращена с поверхностными слоями склеры. Численность ФБ составляла 1971,5+112,0 (84%) клеток в 1 мм2, что в 1,5 раза превышало данный показатель в подгруппе «а» и в 2,3 раза в подгруппе «b» основной группы (p<0,05). Число ПМЛ составляло 117,3+5,0 (5%), что в 1,4 раза меньше содержания данных клеток на 10-е сутки (р<0,05). Численность МНЛ составляла 258,2+14,0 (11%) клеток в 1 мм2, что в 2,5 раза ниже по сравнению с уровнем на 10-е сутки (p<0,05).

На 21-е сутки после операции в подгруппе «а» основной группы (2 кролика) конъюнктива глазного яблока в области вмешательства с 3-минутной аппликацией цитостатика имела нормальное строение, коллагеновые волокна склеры располагались упорядоченно. При этом конъюнктива глаза в зоне операции была отделена от подлежащей склеры узким щелевидным пространством. В клеточном составе преобладали ФБ — 839,4+44,0 (70%) клеток в 1 мм2, уровень которых по сравнению с 14-ми сутками снизился в 1,6 раза (р<0,05). Число ПМЛ составляло 19,5+2,0 (2%), что в 4,3 раза ниже показателя на 14-е сутки (р<0,05). Плотность МНЛ составляла 344,1+11,0 (28%) клеток в 1 мм2, что в 1,4 раза меньше показателя 14-х суток.

В подгруппе «b» основной группы (2 кролика) на 21-е сутки конъюнктива глаза в области операции с 6-минутной аппликацией р-ра Циклоспорина А имела нормальное строение, однако в склере сохранялось рыхлое расположение пучков коллагеновых волокон. Между конъюнктивой глазного яблока и поверхностными слоями склеры в зоне вмешательства обнаруживалось щелевидное пространство. Плотность ФБ составляла 798,8+13,0 (69%) клеток в 1 мм2 среза, что достоверно не отличалось от показателя на 14-е сутки (р<0,05), однако было в 1,6 раза ниже показателя подгруппы «а» основной группы на 14-е сутки. Достоверные различия в плотности ФБ с показателями подгруппы «а» основной группы на 21-е сутки не выявлены. Число МНЛ составляло 319,7+14,0 (28%) клеток в 1 мм2, что в 1,3 раза ниже показателя 14-х суток. Плотность ПМЛ снизилась в 1,5 раза, составив 35,5+3,0 (3%) (р<0,05).

В группе сравнения (2 кролика) на 21-е сутки после операции конъюнктива глаза в области вмешательства имела нормальное строение, пучки коллагеновых волокон склеры плотно прилегали друг к другу. В зоне хирургического вмешательства обнаруживалось плотное конъюнктивально-склеральное сращение. В клеточном составе преобладали ФБ, составляя 1208,5+132,0 (83%) клеток в 1 мм², что в 1,5 раза превышало уровень клеток данной популяции в подгруппе «b» основной группы и в 1,4 раза показатель подгруппы «а» основной группы на 21-е сутки (p<0,05) . Число ПМЛ составляло 116,5+5,0 (8%), что достоверно не отличалось от показателя на 14-е сутки (р<0,05). Плотность МНЛ составляла 131,0±7,0 (9%) клеток в 1 мм², что в 2 раза меньше показателя на 14-е сутки (р<0,05) и в 2,4 раза ниже, чем в подгруппе «b» основной группы на 21-е сутки (p<0,05).

Обсуждение. Согласно результатам экспериментального исследования, в конъюнктиве и склере глазных яблок кроликов после хирургического вмешательства у всех животных развивается воспалительно-репаративная реакция. При этом у животных группы сравнения, прооперированных без местного применения антиметаболита, данная реакция, несмотря на наличие дистрофических изменений в конъюнктивальной и фиброзной оболочках глаз вследствие повышения ВГД, протекает со стереотипной динамикой смены клеточных фаз, обеспечивая быстрое восстановление анатомической целостности поврежденных тканей. Закономерным исходом реакции является формирование у кроликов группы сравнения плотного конъюнктивально-склерального сращения в зоне хирургической травмы. Использование в ходе операции аппликаций 0,05% р-ра Циклоспорина А оказывает выраженное влияние на течение воспалительно-репаративной реакции в конъюнктиве и склере глаз кроликов с изменением типичной смены клеточных фаз. Подавляя миграцию клеток различных популяций в зону оперативного вмешательства, цитостатик обусловливает увеличение продолжительности макрофагальной фазы реак- ции и замедляет переход в фазу регенерации. Смена указанных фаз у животных основной группы, согласно данным морфометрии, началась лишь на 14-е сутки после операции, в то время как у животных группы сравнения на 10-е сутки. Кроме того, на фоне интраоперационной аппликации р-ра Циклоспорина А наблюдается замедление созревания соединительной ткани в области вмешательства, что препятствует формированию конъюнктивально-склерального рубца в послеоперационном периоде.

Заключение. В эксперименте in vivo установлено, что интраоперационная аппликация 0,05% раствора Циклоспорина А у кроликов с индуцированной глаукомой замедляет регенерацию конъюнктивы и склеры в области вмешательства вследствие подавления миграции клеток и изменения стереотипной смены клеточных фаз воспалительно-репаративной реакции, препятствуя формированию рубца. Полученные результаты открывают перспективы для разработки эффективных методов профилактики избыточной регенерации после антиглаукомных операций.