Влияние ионизирующего излучения на активность антиоксидантных ферментов штамма Escherichia coli «ПЛ-6» при многократном облучении

Действие ионизирующих излучений в живых клетках способствует радиолизу воды, при котором происходит образование активных форм кислорода [1-3]. Известно, что радиационное воздействие способно модифицировать деятельность антиоксидантных систем, приводя к изменению их активности [4-7]. Изучение вопроса изменчивости микроорганизмов, в частности, изменения ферментативной активности, актуально и необходимо для понимания механизма развития сверхустойчивости к воздействию ионизирующего излучения (ИИ) [8-13].

Авторами многих работ выявлено модифицирующее влияние на метаболизм различных типов излучения на микроорганизмы [14-16]. Доказано, что изменчивость тесно связана с факторами окружающей среды, но при этом отличительной чертой микроорганизмов являются пластичные свойства всех их составных частей и физиологических функций [17], что позволяет им быстро адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды [18].

Галлямова М.Ю. – мл. науч. сотр.; Вагин К.Н.* – вед. науч. сотр., зав. лаб., д.б.н., ФГАОУ ВО КФУ; Гайнутдинов Т.Р. – вед. науч. сотр., зав. сект. к.б.н., ФГАОУ ВО КФУ; Рахматуллина Г.И. – ст. науч. сотр., зав. сект., к.б.н.; Рыжкин С.А. – ст. науч. сотр., зав. каф., д.м.н., доцент, ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России, ФГАОУ ВО КФУ. ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Согласно литературным данным, одним из ключевых механизмов радиозащитного действия ферментов является инактивация свободных радикалов, возникающих в живых клетках при облучении. За осуществление инактивации свободных радикалов отвечает антиоксидантная система, представленная антиокислительными ферментами [19, 20]. За разрушение в живой клетке токсичного пероксида водорода отвечают ферменты каталаза и пероксидаза, поэтому указанные антирадикальные ферменты были выбраны в качестве объектов данного исследования. Облучение изменяет обменные процессы микроорганизмов, в частности, активность ферментов антиоксидантной защиты, соответственно, целью настоящей работы явилось определение активности ферментов каталазы и пероксидазы при радиационном воздействии в различных дозах на культуру клеток штамма Escherichia coli «ПЛ-6».

Материалы и методы

Эксперименты были проведены в лаборатории радиационного контроля и экологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и на кафедре микробиологии КФУ. Объектом исследования был выбран производственный штамм Escherichia coli «ПЛ-6», предоставленный Государственной коллекцией штаммов возбудителей особо опасных инфекций, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Облучение культуры штамма осуществляли на стационарной гамма-установке «Исследователь» с источником излучения ⁶⁰Co. Гамма-установка представляет собой свинцовый контейнер, установленный на станине, в центре контейнера расположен облучатель в виде кассеты с источниками излучения типа ГИК-7-2 на основе радионуклида ⁶⁰Co с суммарной мощностью 0,612 Гр/с, распределение источников круговое, что обеспечивает получение поглощённой дозы объектом достаточно равномерно относительно центра, в который он помещается. Производилось систематическое воздействие ИИ на штамм, сохраняющий жизнеспособность после предыдущего облучения. Дозы, выбранные для работы: от 3,5 до 10 кГр с шагом 0,5 кГр и от 10 до 30 кГр с шагом 5 кГр. Контролем в опыте служила необлучённая клеточная суспензия Escherichia coli . Также определена инактивирующая доза ИИ для полученного ра-диоустойчивого варианта, равная 31 кГр.

Клеточная суспензия штамма с концентрацией 1 млрд м.к./см³ в объёме 5 мл, помещённая в пенициллиновые флаконы, подвергалась гамма-воздействию по 3 флакона на каждую дозу. После облучения производили посев культуры на питательные среды: мясопептонный агар и Эндо по 1 мл на чашку Петри (по 3 чашки). После каждого воздействия ИИ оценивался рост культуры на чашках Петри, из нескольких колоний готовили мазки с окраской по Граму. Посевы культивировали в термостате при температуре 37 °С, через 24 ч выросшие колонии культуры Escherichia coli смывали 0,85% стерильным раствором хлорида натрия, готовили суспензию в концентрации 1 млрд м.к./см³ по стандарту мутности бактерийных взвесей (Ормет, Россия). Культура после каждого облучения подвергалась 3 пассажам на плотной питательной среде. Клеточную суспензию в концентрации 1 млрд м.к./см³ после 3-го пассажа разливали в пенициллиновые флаконы, закупоривали резиновыми пробками, обкатывали алюминиевыми колпачками и вновь подвергали облучению в дозе, превышающей предыдущую.

Для получения экстрактов с целью последующего определения ферментативных активностей культуру клеток исследуемого микроорганизма центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, дважды промывали смесью, содержащей 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,0) и 0,5 мМ ЭДТА. После промывки клетки ресуспендировали в том же буфере и обрабатывали ультразвуком

8 мин при 4 °С, используя ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т (рабочая частота 22 кГц) для разрушения клеток. Клеточные суспензии центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин при 4 °С. Полученные, свободные от клеток, экстракты хранили на льду, определение активности ферментов производили в течение последующих нескольких часов. Анализ активности ферментов был произведён в трёх повторностях.

Определение каталазной активности проводили в суспензии интактных клеток. Диспропорционирование перекиси водорода каталазой фиксировали спектрофотометрическим методом при длине волны 240 нм на спектрофотометре MultiSkan Go (Thermo Fisher Scientific, Finland), применяя молярный коэффициент поглощения для H 2 O 2 39,4 М -1 хсм^-1. Активность определяли в реакционной смеси объёмом 2 мл (50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,0); 0,5 мМ ЭДТА; 10 мМ перекись водорода и 20 мкл клеточной суспензии), в пробу контроля H 2 O 2 не добавляли. За единицу активности каталазы принимали количество 1 мкмоль H 2 O 2 , превращённыхза 1 мин.

Определение пероксидазной активности производили, как и у предыдущего фермента, в свободном от клеток экстракте. Поглощение определяли при длине волны 436 нм в следующей реакционной смеси общим объёмом 2 мл: 50 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7,0); 0,5 мМ ЭДТА; 0,4 мМ о-дианизидина; 10 мМ H 2 O 2 ; 0,3 мМ NaN 3 и 20 мкл клеточного экстракта. За единицу активности фермента принимали количество экстракта, которое приводило к изменению оптической плотности на 0,01 ед. за 1 мин при 436 нм.

Статистическую обработку полученных данных производили при помощи t-критерия Стьюдента при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам проведённой серии облучений выявлено, что повышение дозы ИИ привело к увеличению исходной радиорезистентности штамма, но в то же время каждое последующее облучение клеток, сохранивших жизнеспособность после предыдущего менее интенсивного воздействия, способствовало снижению количества жизнеспособных клеток (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость снижения количества жизнеспособных клеток Escherichia coli штамм «ПЛ-6» от величины поглощённой дозы.

Каталаза – фермент антиоксидантной системы клетки, участвующий в нейтрализации су-пероксид-аниона и пероксида водорода. Нами было выявлено, что с повышением дозы ИИ на культуру клеток Escherichia coli наблюдается увеличение каталазной активности, причём начиная с дозы 3,5 до 7 кГр с шагом 0,5 кГр между облучениями происходит плавное увеличение

(с дозы 4,5 кГр показания активности статистически значимы по отношению к показаниям контрольного образца), а при следующем облучении в дозе 7,5 кГр наблюдается резкий скачок в активности с разницей в 10 единиц, после чего снова наблюдается плавное возрастание активности. В результате каталазная активность интактного варианта составляет 9,8±0,33 единиц, в то время как активность при самой высокой дозе, применяемой в эксперименте, 30 кГр составляет 48,83±0,46 единиц, что примерно в 5 раз больше, чем у необлучённого варианта.

Пероксидаза представляет собой окислительно-восстановительный фермент класса оксидоредуктаз, использующий пероксид водорода в качестве акцептора электронов. Уровень пероксидазной активности повышается с увеличением дозы ИИ. Без облучения активность составила 0,43±0,03 единиц, начиная с первой дозы облучения 3,5 до 7 кГр наблюдается незначительное постепенное увеличение с 0,49±0,01 до 0,75±0,01 единиц (с дозы 4 кГр показания активности статистически значимы по отношению к показаниям контрольного образца). При воздействии дозы в 7,5 кГр зафиксировано повышение в 0,2 единицы от предыдущей дозы – 0,91±0,02. Дозы с 7,5 до 30 кГр, аналогично предыдущим дозам, стимулируют активность пероксидазы. В точке крайней дозы (30 кГр) наблюдается максимальный уровень фермента – 1,77±0,03 единицы. В ходе эксперимента активность пероксидазы возрастает примерно в 4 раза.

Выявленные изменения активности основных представителей клеточной антиоксидантной защиты (каталазы, пероксидазы) демонстрируют прямую зависимость содержания ферментов от дозы воздействия ИИ. Данные по исследованию активности ферментов антиоксидантной системы представлены в табл. 1.

Таблица 1

Исследование активности ферментов антиоксидантной системы Escherichia coli штамма «ПЛ-6» в зависимости от дозы гамма-облучения

Доза, кГр	Каталаза, мкмоль H 2 O 2 /мг белка/мин	Пероксидаза, мкмоль/мин
0	9,8 ± 0,33	0,43 ± 0,03
3,5	10,0 ± 0,08	0,49 ± 0,01*
4	10,7 ± 0,24*	0,52 ± 0,01*
4,5	11,2 ± 0,12*	0,54 ± 0,01*
5	13,0 ± 0,57*	0,57 ± 0,005*
5,5	13,73 ± 0,25*	0,63 ± 0,02*
6	14,0 ± 0,08*	0,68 ± 0,03*
6,5	14,63 ± 0,33*	0,7 ± 0,005*
7	15,23 ± 0,12*	0,75 ± 0,01*
7,5	25,23 ± 0,82*	0,91 ± 0,02*
8	26,97 ± 0,12*	0,97 ± 0,01*
8,5	30,57 ± 1,16*	1,07 ± 0,04*
9	34,83 ± 1,19*	1,16 ± 0,04*
9,5	36,87 ± 0,5*	1,21 ± 0,01*
10,0	37,53 ± 0,31*	1,25 ± 0,01*
15,0	39,17 ± 0,87*	1,31 ± 0,01*
20,0	41,9 ± 0,43*	1,49 ± 0,02*
25,0	45,2 ± 0,57*	1,6 ± 0,01*
30,0	48,83 ± 0,46*	1,77 ± 0,03*

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контрольными значениями; p<0,05, t-тест.

Схожая тенденция повышения активности ферментов каталазы и пероксидазы при облучении культуры клеток может быть связана с выполнением одинаковой функции в клетке – превращение токсичного пероксида водорода в кислород и воду.

Заключение

Подводя итоги проведённого эксперимента, можно заключить, что многократное воздействие гамма-излучения на культуру клеток Escherichia coli штамма «ПЛ-6» при увеличении дозы с каждым последующим облучением способствует усилению синтеза антиоксидантных ферментов: каталазная активность при выбранной схеме облучения возросла пятикратно, а пероксидазная четырёхкратно. Повышенный синтез антиокислительных ферментов можно использовать при конструировании радиозащитных профилактических и лечебных препаратов. Применение веществ микробного происхождения, как составных частей противолучевых препаратов, – перспективное направление радиационной биологии, в частности, ветеринарии, т.к. именно препараты природного происхождения обладают меньшей токсичностью, являются эффективными и безопасными.

Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства КФУ (приоритет 2030).