Влияние ионов меди и кадмия на пигментный комплекс водных растений семейства Hydrocharitaceae

Наиболее информативными для характеристики функционального состояния и продуктивности растений считаются показатели фотосинтетического аппарата [1, 2]. Количество и соотношение пигментов в тканях растений определяют их физиологическое состояние, а также изменения, происходящие в процессе роста, развития и при различного рода стрессах [3, 4].

В последние десятилетия интенсивно изучается влияние на фотосинтетический аппарат растений антропогенных загрязнителей, таких как тяжелые металлы (ТМ) [5, 6]. Накопление ТМ растениями часто приводит к изменениям метаболизма. Среди токсических эффектов, которые ионы ТМ оказывают на фотосинтезирующую активность растений, следует отметить: ингибирование ферментов [7] и различных сайтов реакционных центров фотосистемы II (ФС II), усиление фотоингибирования [8], замедление функций пластоциана и др. [9].

Следует подчеркнуть, что в исследованиях, связанных с изучением влияния ионов ТМ, как правило, изучается их непосредственное действие на те, или иные процессы, оставляя без внимания такой важный аспект, как состояние растений в период последействия.

Медь (Cu) является незаменимым элементом для растений, поскольку входит в состав ряда металлосодержащих ферментов и принимает участие во многих жизненно важных процессах в клетке. Однако при ее содержании в среде в концентрациях, превышающих опти-

мальные, медь становится таким же токсикантом, как и кадмий (Cd), присутствие которого в тканях растений не является необходимым [10].

Целью данной работы стало сравнительное изучение состояния пигментного комплекса водных погруженных растений семейства Hydrocharitaceae при воздействии ионов меди и кадмия, а также в восстановительный период, когда действие металлов прекращается. Исследованные растения представляют собой различные экотипы. В частности, Egeria densa и Hydrilla verticillata выращивали в искусственных условиях, в то время как растения Elodea canadensis отбирались из естественных водоемов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили водные погруженные сосудистые растение Elodea canadensis Michx., Egeria densa (Planch.) Caspari, Hydrilla verticillata (L. fil.) Royle из семейства Hydrocharitaceae (водокрасовые), порядок Alis-matales (частуховые), подкласс Alismatidae (алисматиды), класс Monocotyledones (однодольные).

Растения E. densa и H. verticillata выращивали в искусственных условиях на специализированных питательных средах, а E. canadensis отбирали из оз. Пляжное, которое находится на территории г. Тольятти.

Постановка эксперимента. Перед началом эксперимента побеги растений разрезали на фрагменты весом 3-4 г и помещали их в вегетационные сосуды объемом 1 дм3, содержащие отстоянную водопроводную воду. В опытные варианты добавляли соли Cu(NO3)2, Cd(NO3)2 в концентрации 100 мкМ. Использованная концентрация нитратных солей металлов вы- брана, исходя из ранее исследованных концентрационных и временных зависимостей влияния ТМ на липидный, белковый и пигментный метаболизм водных растений [11]. Растения инкубировали в условиях освещения -1400±200 лк при 10-часовом световом дне и температуре 24оС. В данных условиях растения выдерживали 1, 3 или 10 суток. По истечении заданного времени часть растений промывали в проточной воде и использовали для анализов, а другую помещали в чистую воду и выдерживали 5 суток (период «реабилитации»). Эта часть растений служила для анализа ТМ и пигментов в постстрессовый период.

Методы исследования. Содержание хлорофиллов а и b проводили спектрометрическим методом на Specol (Чехия) в ацетоновой вытяжке и рассчитывали по формулам Lichten-thaler [12]. Расчет доли хлорофиллов в светособирающем комплексе (ССК) производили с учетом того, что, во-первых, весь хлорофилл b находится в ССК, и, во-вторых, соотношение хлорофиллов a/b в ССК равно 1,2 [4].

Содержание ТМ в тканях растений определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре МГА-915 (Россия) после мокрого озоления [13].

Статистическую обработку данных (среднее значение, стандартное отклонение) проводили с использованием стандартных статистических методов (достоверности Стьюдента).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования проводились на трех видах растений, которые относятся к одному семейству Hydrocharitaceae и одной и той же экологической группе водных погруженных растений. Следовательно, они являются наиболее близкородственными видами, как в систематическом, так и экологическом плане. E. densa и H. verticillata являются искусственно культивируемыми растениями в России, а E. canadensis — широко распространенным видом для местных водоемов. В данной работе использованы растения из его природной популяции. Можно полагать, что исследованные растения представляют собой разные экотипы.

Согласно атомно-абсорбционному анализу, инкубация выбранных видов макрофитов в среде, содержащей ионы Cu и Cd, приводила к накоплению этих металлов в тканях растений. Аккумуляция Cu у E. canadensis составила 3,98,5 мг/г сухого веса, у H. verticillata — 5,0-9,6 мг/г, у E. densa — 5,9-8,4 (табл. 1) . Максимальное содержание Cu для E. canadensis и E. densa наблюдалось после 10 суток экспозиции, а для H. verticillata — после 3 суток. В отличие от Cu максимальное накопление Cd зафиксировано в первые же сутки у E. canadensis и в третьи — у H. verticillata. В дальнейшем поглощения Cd не только не происходило, но часть металла, по-видимому, элиминировалась, поскольку его содержание через 3 и 10 суток было ниже, чем в первые сутки.

При перенесении растений в чистую воду (период реабилитации) содержание металлов в тканях уменьшалось. Доля оставшейся Cu составляла 21-26% от поглощенной за весь период инкубации для E. canadensis и свыше 30% — для H. verticillata в период реабилитации от 1 и 3 сутки воздействия . Уменьшение содержания металлов свидетельствовало в пользу их элиминации из растений, что подтверждалось анализами содержания ТМ после 5 суток реабилитации. Например, максимальное содержание Cu в тканях E. densa наблюдалось на 10 сутки эксперимента. Это превышало содержание металла в первые сутки на 30%, а на 3 сутки — на 18%. Анализируя данные по содержанию Cu во всех опытных растениях после периода реабилитации, можно увидеть, что наиболее эффективно процесс элиминации протекает для растений, выращиваемых в среде, содержащей Cu, в течение 3 суток (20-60%). Влияние ТМ на пигментный комплекс растений оценивали по концентрации хлорофиллов и каротиноидов, их соотношению, а также по содержанию хлорофилла в ССК.

Таблица 1. Содержание меди и кадмия в клетках растений семейства Hydrocharitaceae в зависимости от длительности воздействия (мг/г сухой массы)

Вид	Экспозиция, сутки	Инкубирование		Реабилитация
		медь	кадмий	медь	кадмий
Elodea ñanadensis	0	<0,1	< 0,1	< 0,1	< 0,1
	1	3,9 ± 0,6	9,2 ± 0,6	3,0 ± 0,3	2,2 ± 0,4
	3	6, ± 1,2	5,6 ± 0,8	5,3 ± 1,3	2,7 ± 0,1
	10	8,5 ± 1,5	4,6 ± 0,4	6,3 ± 0,9	2,3 ± 0,2
Egeria densa	0	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1
	1	5,9 ± 0,2	3,7 ± 0.1	4,4 ± 0,3	1,2 ± 0,1
	3	6,9 ± 0,4	4,2 ± 0,3	5,2 ± 0,3	0,6 ± 0,1
	10	8,4 ± 0,3	-	7,6 ± 0,4	0,7 ± 0,1
Hydrilla verticillata	0	< 0,1	< 0,1	< 0,1	< 0,1
	1	5,0 ± 0,6	8,0 ± 0,4	3,5 ± 0,7	3,1 ± 0,2
	3	9,6 ± 1,1	10,2 ± 0,5	3,8 ± 0,6	5,4 ± 0,2
	10	5,1 ± 0,4	6,6 ± 0,6	4,8 ± 0,1	4,5 ± 0,5

Изменение количества зеленых пигментов в сравнении с контрольными вариантами представлено на рис. 1. При экспозиции растений с ионами Cu количество хлорофилла а снижалось на 10-80% в зависимости от вида растений и времени экспозиции. Наибольшая деградация хлорофилла а наблюдалась при более длительной экспозиции для H. verticillata. Подобная тенденция, хотя и не столь интенсивная при кратковременной экспозиции в сравнении с ионами Cu, наблюдается и при действии Cd.

Б

С

Рис. 1. Влияние ионов меди и кадмия на содержание хлорофилла а (А) , b (Б) и каротиноидов (С), % от контроля. Я-Медь, □ — кадмий.

Содержание хлорофилла b также менялось под действием обоих металлов, однако изменения имели более умеренный и видоспецифичный характер. Например, под действием Cu уровень хлорофилла b для E. canadensis снизился на 19%, начиная с первых суток воздействия. У E. densa под действием этого же металла содержание хлорофилла b к 3 суткам эксперимента уменьшилось на 23%, а в дальнейшем проявилась тенденция к незначительному увеличению содержания данного пигмента.

При кратковременном влиянии Cd отмечено достоверно значимое увеличение содержания хлорофилла b для H. verticillata (1-3 сутки воздействия) и E. densa (1 сутки). Но при более длительном воздействии уровень хлорофилла b снижался для E. canadensis и E. densa как в сравнении с контролем, так и в сравнении с кратковременным воздействием (рис. 1Б). Необходимо подчеркнуть, что для растений вида E. canadensis, которые представляют природный экотип, резкого изменения в содержании хлорофилла b отмечено не было.

В целом хлорофилл b оказался более устойчивым к действию Cu и Cd, чем хлорофилл a. Однако суммарное содержание хлорофилла a и b снижалось во всех экспериментах (табл. 2).

140           E. canadensis

1 с.               3 с.               10 с.

A

Б

С

Рис. 2. Изменение содержания хлорофилла a (A), b (Б) и каротиноидов (С), % от контроля в период последействия. ^И- Медь,□ - кадмий.

Динамика содержания каротиноидов, как и хлорофиллов, зависела от вида экзогенного металла и вида растений. При действии Си их количество снижалось по отношению к контролю более чем на 50%, начиная с первых суток воздействия для E. canadensis и для E. densa и с 3 суток — для H. verticillata. Аналогичная динамика содержания пигментов наблюдается и для растений при добавлении Cd.

Отношение хлорофилла а к b в контрольных опытах у разных видов варьировало в небольшом интервале — от 2,4 до 2,6. Под действием Си отношение хлорофиллов a/b снижалось для всех видов растений. Под действием Cd изменение этой величины имело аналогичный характер для искусственно культивируемых растений (E. densa и H. verticillata) и оставалось практически неизменным для E. canadensis, представляющих природный экотип. Согласно представлениям X. Лихтенталлера [12], изменения этого соотношения свидетельствует о перестройке ультраструктуры хлоропластов, направленной на увеличение доли тилакоидов стромы или гран. Преобладание хлорофилла a формирует хлоропласты светового типа с преобладанием тилакоидов стромы, а хлорофилла b — хлоропласты с преобладанием тилакоидов гран. Можно предположить, что в условиях наших экспериментов также возможны аналогичные изменения в ультраструктуре хлоропластов. В изменении данного показателя просматривается зависимость от вида металла и экотипа растения.

Одним из показателей состояния пигментного комплекса хлоропластов, наравне с рассмотренными выше, является расчетная величина содержания хлорофилла в ССК от суммы хлорофиллов. При отсутствии металла в среде доля ССК для исследованных видов водных растений составляла 61,0-65,1% от суммы хлорофиллов. Анализ данных по величине пигментов ССК в условиях накопления металлов по- казал, что эта величина лабильна, а ее изменение зависело от металла и вида растения. Под действием Cu отмечен одинаковый характер изменения — увеличение уровня пигментов ССК. Увеличивалась доля ССК и под действием Cd, но только для искусственно культивируемых растений, в то время как у E. canadensis эта величина практически не менялась. Основная функция пигментов ССК состоит в поглощении и передачи энергии квантов света в реакционные центры. Полученные нами результаты показывают, что у растений, испытывающих влияние ионов Cu и Cd, происходит изменение соотношения между комплексами реакционных центров фотосистем и ССК, что не может не сказаться на эффективности фотосинтеза.

Таблица 2. Влияние ионов меди и кадмия на содержание хлорофиллов в фотосинтетическом аппарате водных погруженных растений семейства Hydrocharitaceae

S ад	Me-талл/ время	Аккумуляция			Реабилитация
		Хл a + b	Хл a / b	% Хл ССК *	Хл a + b	Хл a / b	% Хл ССК *
к "У О К О О	Cu 0	1,06	2,4	64,3	1,06	2,4	64,3
	Cu 1	0,77	2,1	71,4	0,66	1,9	77,7
	Cu 3	0,58	1,5	87,2	0,55	1,6	84,0
	Cu 10	0,62	1,6	54,2	0,38	1,5	86,8
	Cd 0	1,06	2,4	64,3	1,06	2,4	64,3
	Cd 1	0,93	2,2	68,6	0,90	2,5	41,5
	Cd 3	0,65	2,4	64,3	0,71	2,5	62,0
	Cd 10	0,81	2,4	65,2	0,37	2,4	65,4
о '1 i	Cu 0	0,71	2,4	65,1	0,71	2,4	65,1
	Cu 1	0,73	2,5	63,3	0,30	1,5	88,0
	Cu 3	0,32	1,7	82,5	0,26	1,9	76,1
	Cu 10	0,18	1,2	97,8	0,22	1,2	99,0
	Cd 0	0,71	2,4	65,1	0,71	2,4	65,1
	Cd 1	0,70	1,5	88,0	0,80	1,7	82,5
	Cd 3	0,60	1,4	91,7	0,52	1,6	84,6
	Cd 10	0,52	1,5	88,8	0,40	1,5	88,0
О К "У ’о	Cu 0	0,54	2,6	61,0	0,50	2,8	58,0
	Cu 1	0,39	1,8	79,0	0,52	1,3	96,0
	Cu 3	0,26	1,4	92,0	0,12	1,4	92,0
	Cu 10	0,27	1,1	107	0,17	1,1	106,0
	Cd 0	0,54	2,6	61,0	0,50	2,8	58,0
	Cd 1	0,39	2,2	66,7	0,16	1,7	81,2
	Cd 3	0,28	2,1	71,4	0,20	1,5	90,0
	Cd 10	0,1	1,5	90,0	0,04	1,0	99,0

Примечание * - %от суммы хлорофиллов

Таким образом, анализ фотосинтетических пигментов показал, что оба металла в выбранной нами концентрации оказывают негативный эффект на содержание пигментов водных растений. Хотя у всех растений наблюдалось уменьшение суммы хлорофиллов и содержания каротиноидов по сравнению с контролем, для E. с anadensis , представляющих природную популяцию , уровень изменений был наименьшим .

В реабилитационный период увеличение количества хлорофилла а в сравнении с периодом накопления отмечено после краткосрочно го (1 сутки) воздействия обоих металлов на растения вида E. densa. При более длительной экспозиции происходит дальнейшее снижение концентраций данного пигмента в тканях этого вида растений. Для H. verticillata достоверное увеличение количества хлорофилла а происходило после 1 суток воздействия кадмия. В случае с E. canadensis восстановления хлорофилла а не наблюдали.

В отношении хлорофилла b можно отметить, что он оказался более устойчивым в сравнении с хлорофиллом а , поскольку в реабилитационный период его уровень менялся незначительно. В результате, сумма хлорофиллов а и b , а также их отношение практически не менялось в сравнении с периодом накопления металлов. Не менялось также относительное содержание пигментов ССК в общем пуле хлорофиллов.

Изменение в количественном содержании каротиноидов в восстановительный период носит видоспецифический характер. У E. canadensis и H. verticillata происходит дальнейшее снижение содержания пигментов, а для E. densa — увеличение содержания каротиноидов при реабилитации от 1-суточного воздействия металлов.

Полученные нами результаты согласуются с многочисленными исследованиями, в которых отмечается, что при накоплении растениями ТМ часто происходит деградация хлорофилла [6, 14-16]. Одной из причин снижения количества пигментов является окисление хлорофиллов активными формами кислорода [5]. При малых концентрациях Cu в среде возможна замена ионов Mg ²⁺ в хлорофилле на Cu ²⁺ . При более высоких концентрациях Cu может приводить к редукции синтеза аминолевуленовой кислоты — предшественника хлорофиллов и протохлорофеллид редуктазы, которая катализирует восстановительное формирование хлор-филида из протохлорфелида при биосинтезе хлорофиллов [17]. Cd, кроме того, подавляет активность донорного участка ФС II, ингибирует ферменты цикла Кальвина [18]. Конечным результатом негативного влияние металлов является изменение внутриклеточного состава. Известно, что уже при невысоком содержании ионов Сd в среде происходит уменьшение размеров хлоропластов клетки, а при высоких концентрация металла наблюдается снижение и числа зеленых пластид клетки [19]. Полученные нами данные свидетельствуют о существенном изменении метаболизма, связанном, по-видимому, с изменением ультраструктуры хлоропластов и количеством пластид.