Влияние ионов меди на физиологические процессы в культуре клеток и растениях огурца

В статье приведены сравнительные данные по реакции каллусной ткани и проростков огурца на различные концентрации ионов Си31- Выявлено различное действие иоков Си2* в проростках и каллусах огурца на изменения активности каталазы, супероксиддисмутазы (СОД) и аскорбат-пероксидазы (АПО), а также на параметры окислительного стресса (усиление генерации О2, интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ)).

Тяжелые металлы (ТМ) из природных и антропогенных источников являются поллютантами, многие из них в высоких концентрациях могут оказывать токсическое влияние на растения. Некоторые из ТМ, например медь, являются необходимыми микроэлементами в живой системе; они являются ко-факторами или входят в состав про-стетических групп ферментов, вовлеченных в метаболические пути. С другой стороны, тяжелые металлы могут оказать пагубное воздействие на количество и качество урожая растений. Изучение механизмов и пределов резистентности культурных растений к действию ТМ является одной из важнейших задач современной экологической физиологии растений. Хорошую модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам представляет культура клеток высших растений [6]. Ранее была показана возможность использования каллусных культур огурца в качестве объекта для изучения холодового повреждения [8]. Проведены работы по изучению влияния регуляторов роста на морфогенез и холодоустойчивость эпигенетически различных каллусных линий огурца [5], получены культуры с повышенной холодоустойчивостью [4]. Однако при анализе стрессоустой-чивости на клеточном и организменном уровнях необходимо знать сходства и различия в реакции разных объектов.

В работе приведено изучение влияния ионов меди на физиологические процессы в культуре клеток in vitro и растениях огурца in vivo.

В качестве объекта исследования был выбран огурец Cucumis satwus L. *един- ство*. В ходе работы параллельно проводились два эксперимента: 1) определение влияния ионов Си2+ на физиологические показатели у растений огурца in vivo; 2) получение каллусной культуры огурца и определение влияния ионов Си2* на физиологические показатели у огурца in vitro.

Первый эксперимент включал в себя следующие этапы:

• 1)    выращивание растений огурца в константных условиях (освещенность 2 000 лк, температура 28 °C, фотопериод 12 ч) на различных концентрациях CuSO. х 5HLO (10 мкМ, 0,1 мМ, 1 мМ);

• 2)    определение активности антиоксидантных ферментов (каталазы, СОД, АПО) и скорости генерации супероксидного ани-он-радикала (Oj) и интенсивности ПОЛ.

Во втором эксперименте для получения каллусной культуры проводили стерилизацию семян, выращивание стерильных растений на мостиках и эксплантацию растений по методике, приведенной в [2]. Затем осуществляли выращивание каллусных линий огурца в термостате при температуре 21 — 22 С в течение 4 — 6 недель на среде Мура-сиге — Скуга (МС) с добавлением различных концентраций CuSO4x 5Н2О (10 мкМ, 0,1 мМ, 1 мМ). По прошествии времени выращивания в каллусных линиях определяли активность антиоксидантных ферментов (каталазы, СОД, АПО), а также скорость генерации супероксидного анион-ра-дикала и интенсивность ПОЛ по методике А. С. Лукаткина с модификациями [7]. Все определения проводили в 3—4 отдельных опытах, каждый из которых состоял из нескольких биологических повторностей. Значения на рисунках представляют средние

Исследование выполнено при поддержке Федерального агентства по образованию (АВЦП ♦Развитие научного потенциала высшей школы», проект 2.1.1/624).

арифметические из всех опытов с их стандартными ошибками. Статистическую обработку проводили с помощью программы Microsoft Excel 2003.

В результате первой серии опытов получены данные по влиянию ионов Си2* на физиологические показатели у семидневных проростков огурца, выращенных на среде с добавлением ионов; меди.

Активность каталазы в семядольных листьях огурца in vivo возрастала почти линейно с увеличением концентрации ионов Си1* (рис. 1). Это может косвенно свидетельствовать о том, что увеличение дозы тяжелого металла (меди) при выращивании растений огурца вызывает сильный окислительный стресс в растениях, индуцирующий усиленную генерацию активированных форм кислорода. Известно, что каталаза является индуцибельным ферментом, т. е. ферментом, активность и содержание белка которого резко увеличивается при повышении концентрации субстрата в среде [7]. Поскольку субстратом для каталазы является пероксид водорода, очевидно, что ионы Си2* вызывают существенное увеличение образования Н2О2 в тканях листьев огурца, что заставляет каталазу работать более интенсивно. При этом просматривается прямо пропорциональное увеличение активности каталазы с возрастанием дозы CuSO4 х к 5Н2О в среде.

Основной источник образования пероксида водорода в растительных тканях при стрессовых воздействиях — фермент супе-роксиддисмутаза, которая катализирует дис-мутацию Оз с образованием Н2О2 [7].

Из рис. 2 видно, что активность СОД, выраженная в процентах к водному контролю, изменялась in vivo при внесении в среду ионов меди очень существенно. Так, при концентрации 10 мкМ отмечено снижение активности на 78 %. В остальных случаях активность резко возрастала — на 114 и 69 % к водному контролю при концентрациях Си^г*0,1мМ и 1 мМ соответственно. Это может указывать на то, что низкая концентрация ионов Си²* (10 мкМ) выступает для растений огурца в качестве микроэлемента [1] и потому не только не активирует СОД, ио и снижает ее. Более высокие концентрации Си²* вызывали резкое увеличение активности СОД, что также свидетельствует об индукции окислительного стресса в проростках огурца, выращенных на растворах CuSO₄ х 5Н₃О с такими концентрациями. Повышение активности СОД приводит к усиленной дисмутации О₂ с образованием больших количеств пероксида водорода.

Рисунок 2

Активность СОД в семядольных листьях семидневных проростков огурца, выращенных с добавлением различных концентраций ионов меди

Рисунок /

Активность каталазы в семядольных листьях семидневных проростков огурца, выращенных с добавлением различных концентраций ионов меди

При изучении АПО не выявлено четкой зависимости активности фермента in vivo от концентрации ионов Си2*: она оставалась во всех вариантах примерно одинаковой с контролем, кроме концентрации 0,1 мМ, где активность возросла на 20 % (рис. 3). Можно предположить, что АПО является ферментом, не чувствительным к Си2*, и работает независимо от его концентрации.

При изучении зависимости скорости генерации супероксидного анион-радикала от содержания ионов Си2* в среде можно видеть, что уровень образования этой АФК in vivo возрастал относительно контроля во всех вариантах опыта (рис. 4). Наибольшее увеличение данного показателя (более чем в 4 раза к водному контролю) произошло на среде с концентрацией ионов меди, равной 1 мМ. Самое малое увеличение образования Оз относительно контроля наблюдали на среде с концентрацией ионов Си24, ранной 0,1 мМ, - на 92 %. Концентрация 10 мкМ показала среднее усиление генерации О2 по отношению к водному контролю — в 2,6 раза. Очевидно, что все концентрации тяжелого металла (меди) индуцируют в клетках растений огурца возпикнове- ние окислительного стресса; при этом невысокие дозы металла (0,1 и 10 мкМ) усиливают генерацию АФК в небольшой степени и, следовательно, вызывают слабый окислительный стресс, а высокая доза ионов меди (1 мМ) приводит к сильному стрессу. В то же время из наших опытов не совсем понятно, почему более сильная генерация О2 при дозе Си24 10 мкМ сопровождалась значительным подавлением активности СОД (см. рис. 2). Вероятно, здесь происходило нсспепифическое воздействие ионов ТМ на белок фермента [7].

Рисунок 3

Активность АПО в семядольных листьях семидневных проростков огурца, выращенных с добавлением различных концентраций ионов меди

Рисунок 4

Скорость генерации супероксидного анион-радикала в семядольных листьях семидневных проростков огурца, выращенных с добавлением различных концентраций ионов меди

При изучении интенсивности ПОЛ в растениях огурца было установлено, что этот показатель при высоких дозах ионов меди в среде возрастал относительно контроля (рис. 5). При этом с увеличением дозы Си24 в среде интенсивность ПОЛ повышалась, достигая максимума при концентрации 0,1 мМ — на 197 % к уровню водного контроля. Это свидетельствует о неблагоприятном влиянии ионов меди (особенно высоких концентраций) на растение огурца, поскольку усиление ПОЛ является показателем значительного повреждения ненасыщенных мембранных липидов и, следовательно, клеточных мембран [7]. В этом опыте видно почти линейное усиление ПОЛ и соответственно повреждения мембран в семядольных листьях огурца при повышении концентрации ионов Си24 в среде, что подтверждает данные литературы о токсическом дейстии ионов меди на растения [9].

Во второй серии опытов изучали влияние ионов Си24 на физиологические показатели у пятинедельных каллусных культур огурца, полученных от экспланта гипоко- тильного и листового происхождения. Тяжелый металл воздействовал на антиоксидантные ферменты различно, но в высокой концентрации чаще повышал активность.

Так, активность каталазы в каллусной культуре огурца гипокотильного происхождения не изменялась при самой низкой концентрации меди, слегка снижалась при дозе 0,1 мМ и возрастала при самой высокой концентрации (1 мМ) (рис. 6). Это свидетельствует о токсичном влиянии высоких концентраций Си24 на каллусную культуру огурца.

Активность АПО в каллусе огурца, выращенном на среде МС с добавлением CuSO4 х 5Н2О, оставалась примерно на одном уровне с контролем, кроме концентрации 1 мМ, где активность фермента возросла на 73 % (рис. 7). Это еще раз подтверждает токсичное действие данной концентрации на каллусную культуру огурца гипокотильного происхождения.

Активность СОД понижалась во всех вариантах опыта относительно контроля (рис. 8). Возможно, это связано с тем, что ионы меди прямо ингибировали фермент за счет токсического действия на структуру белка СОД [6]. Правда, остается невыясненным, почему степень ингибирования СОД в разных вариантах не пропорциональна концентрации ионов меди.

При изучении возможного прооксидант-ного действия ионов меди обнаружено, что и скорость генерации супероксидного анион-радикала, и активность ПОЛ понижались при действии Си24 в каллусах огурца листового происхождения относительно контроля. Можно предположить, что иолы меди не вызывали стрессовой реакции в каллусной культуре огурца.

Так, скорость генерации супероксидного анион-радикала снижалась относительно контроля во всех вариантах опыта (рис. 9). Падение образования О; находилось в пределах 40 — 60 % к водному контролю и было самым большим при минимальной дозе Си24 в среде.

Интенсивность ПОЛ понижалась относительно контроля во всех вариантах опыта (рис. 10). Падение было в пределах от 55 до 30 %. Причины такого снижения генерации супероксидного анион-радикала и интенсивности ПОЛ в каллусах огурца при действии ионов меди не ясны.

Интенсивность ПОЛ в семядольных

Рисунок 6

Активность каталазы в пятинедельной каллусной культуре огурца, выращенной с добавлением различных концентраций ионов меди

листьях семидневных проростков огурца, выращенных с добавлением различных концентраций ионов меди

Рисунок 7

Активность АПО в пятинедельной каллусной культуре огурца гипокотильного происхождения, выращенной с добавлением различных концентраций ионов меди

Рисунок 8

Активность СОД в пятинедельной каллусной культуре огурца гипокотильного происхождения, выращенной с добавлением различных концентраций ионов меди

Рисунок 9

Скорость генерации супероксидного анион-радикала в пятинедельной каллусной культуре огурца листового происхождения, выращенной с добавлением различных концентраций ионов меди

Активность ПОЛ в пятинедельной

каллусной культуре огурца листового происхождения, выращенной с добавлением различных концентраций ионов меди

Исходя из полученных результатов можно сделать следующие выводы.

• 1.    Ионы Си²* в концентрации 1 мМ угнетающе действовали на габитус проростков огурца и каллусной ткани, в то время как концентрация 10 мкМ стимулирующе влияла на растения и культуру клеток огурца.

• 2.    При действии различных концентраций ионов Си²* наблюдали повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы в проростках огурца, прогрессирующее с увеличением концентрации, и отсутствие изменения активности аскорбат-пероксидазы. В каллусе повышение активности антиокси

• 3.    Показано усиление генерации О; и интенсивности перекисного окисления липидов в семядольных листьях огурца, свидетельствующее о возникновении окислительного стресса, прогрессирующего с повышением концентрации Си²*. В то же время в каллусной культуре огурца окислительный стресс при действии ионов Си²* не обнаружен.

• 4.    Ионы Си²* оказывают большее влияние на проростки огурца, чем на каллусную культуру.

дантных ферментов происходило только при самой высокой концентрации Си2* (1мМ).