Влияние экстракта ягод малины обыкновенной (Rubus idaeus L.) на продолжительность жизни Drosophila melanogaster

Малина обыкновенная ( Rubus idaeus L.) содержит разнообразный спектр биологически активных соединений и является одной из широко потребляемых в пищевых и лечебных целях ягод семейства Rosaceae . Например, малиновый сироп активно используют как жаропонижающее и потогонное средство [1]. Ягоды малины обладают противовирусными, антимикробными, противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами, а также проявляют антиоксидантную активность [2–4].

В составе ягод содержатся макро- и микроэлементы (Ca, Fe, Mg, K, Na, Zn, Cu, Se и др.), витамины (E, B6, C, A и др.), пищевые волокна. Для них характерен уникальный полифенольный профиль с высоким содержанием антоцианов (цианидин, дельфинидин) и эллагитанина, а также флавонолы (кверцетин, кемпферол) [5]. Эксперименты in vitro с имитацией процесса пищеварения показали, что флавоноиды, фенольные кислоты и антоцианы свежей малины ( Rubus idaeus L.) сохраняют биодоступность для дальнейшего усвоения организмом [6, 7].

Фитохимические вещества, содержащиеся в ягодах, обладают различной биологической активностью, что делает целесообразным их использование для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, снижения риска развития сахарного диабета, рака, ожирения и нейродегенерации [5, 8, 9].

Многие дегенеративные заболевания, такие как рак, атеросклероз и сахарный диабет, являются результатом вредного воздействия свободных радикалов на клеточные системы. Содержащиеся в ягодах малины полифенолы, особенно антоцианы, известны как мощные антиоксиданты и могут нейтрализовать активность свободных радикалов, а также восстанавливать повреждения, вызванные свободными радикалами [10] .

Ранее было описано, что различные растительные экстракты плодов (вишни, аронии, черники и др.), содержащие большое количество антоцианов, способны увеличивать продолжительность жизни и устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды модельных организмов Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans [11–13]. Так, например, экстракт плодов черноплодной рябины (× Sorbaronia mitschurinii ) увеличивал медианную продолжительность жизни самцов D. melanogaster с моделью бокового амиотрофического склероза на 22 % [14], а также увеличивал продолжительность жизни самок дрозофил со сверхэкспрессией предшественника бе-та-амилоида человека UAS-Aβ42 до 11 % [15]. Экстракт рябины обыкновенной ( Sorbus aucuparia L.) также способен увеличивать продолжительность жизни D. melanogaster , устойчивость самцов к голоданию, а самок - к действию гипертермии [16]. В зависимости от концентрации экстракт барбариса обыкновенного ( Berberis vulgaris L.) способен увеличивать продолжительность жизни, также может способствовать устойчивости к воздействию стресс-фак-торов, целостности кишечного барьера, скорости метаболизма, сохранению двигательной активности особей Drosophila melanogaster и проявлять антиоксидантную

(с применением тестов эритроцитов) и антигликирующую активность (с использованием гликирования бычьего сывороточного альбумина) ( in vitro ) [17].

Цель данной работы – оценка эффектов экстракта ягод малины обыкновенной ( Rubus idaeus L.) на продолжительность жизни особей Drosophila melanogaster .

Материалы и методы

Сбор материала. Сбор плодов малины обыкновенной производился в августе 2020 г. в Ботаническом саду (Научная коллекция живых растений № 507428) Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар, Республика Коми). Для дальнейших приготовлений экстрактов ягоды замораживали при температуре -20ºС. Для сохранения антоцианового профиля плодов использовали этанольный метод экстракции.

Приготовление экстракта. Для приготовления экстракта плоды измельчали и центрифугировали для получения надосадочной жидкости. Эту массу смешивали с глиной и снова центрифугировали. Глину готовили путем смешивания сухого порошка глины с 0,1 М соляной кислоты. Образовавшуюся жидкость сливали и смешивали с экстрагентом: 1%-ный раствор концентрированной соляной кислоты в 96%-ном этиловом спирте. Полученный раствор центрифугировали, а затем этанол и соляную кислоту из экстракта упаривали на вакуумно-ротационном испарителе ИР-1М (Химлаборприбор, Россия) при +40° С для высушивания остатка. Поскольку антоцианы встречаются в растениях в виде солей с сахарными фрагментами, экстракцию проводили кислым раствором, дающим максимальный выход. Фенольные соединения растений в этих условиях плохо растворимы и выход их незначителен. Полифенольные соединения нерастворимы и могут осаждаться в описанных условиях. Экспериментальные концентрации экстракта ягод готовили из полученного этанольного экстракта путем разбавления в 96%-ном этаноле.

Высокоэффективная жидкостная хроматография – масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС). Образцы экстракта из ягод малины анализировали на системе ВЭЖХ Thermo Finnigan Surveyor, оснащенной матричным диодным детектором (200–600 нм) и масс-селективным детектором (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Детекцию проводили при длине волны 520 нм, скорости подачи элюента 1 мл/мин, времени анализа 40 мин, в изократическом режиме. В качестве элюента использовали раствор ацетонитрила и 10%-ной муравьиной кислоты (7,93 об./об.) в воде. Применяли хроматографическую колонку 4×250 мм с сорбентом Диасорб-130-С16Т (размер частиц – 7 мкм). Для пробоподготовки 1 мг экстракта растворяли в 10 мл деионизированной воды, после чего наносили на подготовленный картридж с сорбентом Hypersep C18. Картриджи промывали 1 мл элюента с последующей промывкой 10 мл деионизированной воды. Масс-спектры получали на жидкостном хроматографе Thermo Finnigan LCQ Fleet (Thermo Fisher Scientific Inc., США) в сочетании с ионизацией электрораспылением при кинетической энергии 40 эВ.

Соединения, выделенные из экстракта в чистом виде, использовали в качестве стандартов для ВЭЖХ-МС, а также для количественного анализа. Строение этих соединений подтверждено методами ИК-, УФ- и ЯМР-спектроскопии, дополнительно молекулярными ионами в МС.

Условия содержания плодовых мушек. Контрольные и экспериментальные особи были собраны в течение 24 ч после вылупления имаго. С использованием углекислотного наркоза (Genesee Scientific, США) мух сортировали по полу и рассаживали в пробирки по 30 особей. Самцов и самок содержали раздельно. Начиная с первого дня жизни имаго ежедневно вели подсчет числа умерших особей, два раза в неделю мух переносили на свежую среду. Контрольных и экспериментальных мух содержали при температуре +25° С и 12-часовом режиме освещения. Для поддержания стабильных условий содержания использовали климатические камеры Binder KBF720-ICH (Binder, Германия). Состав питательной среды, на которой содержали контрольных и опытных животных при проведении всех экспериментов, был аналогичен контрольной диете из работы [18]: вода – 1 л, кукурузная мука – 92 г, сухие дрожжи – 32,1 г, агар-агар – 5,2 г, глюкоза – 136,9 г, раствор 10 % нипагина в этаноле – 10 мл, раствор 50 % пропионовой кислоты – 10 мл. Экстракт малины в растворе 96 % этанола наносили на поверхность питательной среды в объеме 30 мкл на пробирку.

В качестве контроля использовали среду с добавлением этилового спирта в том же объеме. Изучали экстракт малины в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 2,5 и 5 мг/мл.

Анализ продолжительности жизни. Для анализа продолжительности жизни (ПЖ) на каждый вариант эксперимента отбирали свежевылетевших имаго (150 особей) по 30-32 особи на каждую пробирку, разделяя по полу (самки и самцы содержались отдельно). Далее производили расчет медианной и максимальной (возраст 90 % смертности особей) ПЖ. Проводили три независимые биологические повторности.

Статистическая обработка результатов. Для оценки достоверности различий между кривыми дожития использовали критерий Колмогорова-Смирнова [19, 20]. Значимость различий между кривыми выживаемости оценивали с помощью логрангового теста [21]. Для оценки статистической значимости отличий по медианной ПЖ использовали логранговый критерий Мантеля-Кокса и критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона [22, 23]. Достоверность различий по максимальной ПЖ оценивали с помощью метода Ванг-Аллисона [24]. Анализ статистических данных выполняли с помощью программы Statistica 13 (TIBCO Software, США), статистической среды R, версия 2.15.1 (The

R Foundation), и онлайн приложения для анализа выживаемости OASIS2 [25].

Результаты и их обсуждение

Анализ состава экстракта малины обыкновенной. С использованием ВЭЖХ-анализа в экстракте плодов малины были обнаружены следующие антоцианидины: дельфинидин (Gal), пеларгонидин (Gal), пеларгонидин (Glu), пеларгонидин (Ara) (рис. 1).

Рисунок 1. Образец высокоэффективной жидкостной хроматографии экстракта ягод Rubus idaeus L. Условные обозначения. 1,88 мин. – дельфинидин (Gal); 2,44 – пеларгонидин (Gal); 3,59 – пеларгонидин (Glu); 5,13 – пеларгонидин (Ara).

Figure 1. A sample of high–performance liquid chromatography of Rubus idaeus L. berry extract.

Keys. 1.88 min. – delphinidine (Gal); 2.44 – pelargonidine (Gal); 3.59 – pelargonidine (Glu); 5.13 – pelargonidine (Ara).

Эффекты экстракта малины обыкновенной на продолжительность жизни Drosophila melanogaster. Мы изучили влияние этанольного экстракта плодов малины ( Rubus idaeus L.) на продолжительность жизни Drosophila melanogaster в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 2,5 и 5 мг/мл. Кормление дрозофил экстрактом малины производилось на протяжении всей жизни (в трех независимых повторностях), результаты представлены на рис. 2 и в таблице.

В итоге проведенных экспериментов обнаружено, что у самок в трех повторностях воспроизводится эффект экстракта малины в концентрации 2,5 мг/мл на ПЖ. Наблюдается снижение медианной ПЖ от 2 до 7 % (p<0,01), а также максимальной ПЖ на 3 и 5 % (p<0,01) в двух повторностях. Кроме того, при обработке экстрактом в концентрации 5 мг/мл также наблюдали снижение медианной ПЖ на 2 и 6 % (p<0,01), а максимальной ПЖ – на 3 и 5 % (p<0,05) в двух независимых повторностях. У самцов отмечалось снижение медианной ПЖ на 8 % при концентрации экстракта малины 0,1 мг/мл (в одной повторности) и максимальной ПЖ – на 1 % при концентрации экстракта 1 мг/мл (в другой повторности) (рис. 2, таблица). В остальных вариантах эксперимента не было показано воспроизводимых по повторностям эффектов экстракта малины на показатели

Рисунок 2. Влияние экстракта малины на продолжительность жизни самцов (А, В, Д) и самок (Б, Г, Е) Drosophila melanogaster .

Условные обозначения. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, критерий Колмогорова-Смирнова с учетом поправки Бонферрони.

Figure 2. The effect of raspberry extract on the lifespan of male (A, B, Д) and female (Б, Г, E) of Drosophila melanogaster .

Keys. *p<0.05; **p<0.01; ***p< 0.001, Kolmogorov-Smirnov test with Bonferroni correction.

родных фенольных соединений (включая антоцианы) может включать несколько механизмов: антиоксидантные эффекты и нейтрализацию свободных радикалов, регуляцию активности клеток, связанных с воспалением, влияние на активность ферментов, участвующих в метаболизме арахидоновой кислоты (фосфолипаза A2, липоксигеназа, циклооксигеназа) и индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS), регуляция продукции провоспали-тельных соединений (например, факторов транскрипции, NF-κB, провоспалительных цитокинов) и модуляция экспрессии провоспалительных генов [29, 31].

Проведенные нами ранее исследования свидетельствуют о неоднозначной роли антиоксидантных свойств антоцианов в эффектах на продолжительность жизни дрозофил. Например, ранее нами был изучен дельфинидин, который увеличивал медианную ПЖ самок на 4 %, но при этом у самцов Drosophila melanogaster он снижал медианную продолжительность жизни на 5 % [13]. Ряд экспериментов демонстрирует, что экстракты ягод могут иметь геропротекторный эффект при оптимальных дозах и условиях. Например, экстракт черноплодной рябины в концентрации 2,5 мг/мл значительно увеличивал ПЖ самцов дрозофил на 18 % по сравнению с контролем [32]. Экстракты других ягод также показали подобный результат: добавление 5 мг/мл экстракта черники в корм приводило к увеличению медианной ПЖ мушек примерно на 10 % [33], экстракт клюквы в концентрации 20 мг/мл также увеличивал ее на 10 % [34]. Антиоксидантные свойства антоцианов этих ягод ассоциировались с повышением экспрессии генов антиоксидантной

ПЖ как у самцов, так и у самок (рис. 2, таблица). Полученные данные говорят о токсическом эффекте больших доз (2,5 и 5 мг/мл) экстракта малины на показатели ПЖ самок при кормлении на протяжении всей жизни дрозофил, а также об отсутствии воспроизводимого эффекта на ПЖ самцов.

Известно, что различные полифенолы (флавоноиды, фенольные кислоты, антоцианы и т. д.) растительного и синтетического происхождения проявляют геропротек-торный эффект на разнообразных модельных организмах in vivo и in vitro [26]. Проведенный нами ВЭЖХ-анализ показал, что экстракт малины обыкновенной содержит дельфинидин и пеларгонидин, которые являются основными представителями антоцианов [27].

Известно, что растительные полифенолы, особенно антоцианы, характеризуются мощными антиоксидантными свойствами [9, 10, 26, 28-30]. Механизм антиоксидантного действия этих соединений разнообразен: удаление свободных радикалов, хелатирование ионов переходных металлов (меди, железа), ингибирование ферментов, участвующих в образовании активных форм кислорода, индукция эндогенных антиоксидантных ферментов и предотвращение перекисного окисления липидов [28]. Противовоспалительная активность при- защиты SOD1, CAT и подавлением ассоциированного со старением гена мафусаил (MTH) [33, 34].

Известно, что плоды малины помимо антоцианов содержат еще и эллаготанины, фенольные кислоты, катехины, проантоцианидины, которые оказывают антиоксидантные, противовоспалительные, противораковые, антимикробные свойства [35]. Ранее было описано, что экстракт малины (80 мг/мл) увеличивал среднюю продолжительность жизни Caenorhabditis elegans до 30 % [36]. Лиофилизированная черная малина, добавленная в диету мышам Apc^Min/+ (модель колоректального рака), увеличивала медианную выживаемость самцов до 189 дней и самок – до 258 дней, по сравнению с выживаемостью у контрольных самцов (143 дня) и самок (194 дня) [37].

В нашем исследовании экстракт малины обыкновенной вызывал снижение показателей ПЖ только при его использовании в наиболее высоких концентрациях. Известно, что длительное воздействие высоких концентраций растительных полифенолов, которыми богата малина, может быть пагубным. Подобное дозозависимое действие видно на примере черноплодной рябины: в эксперименте при концентрации 0,1 мг/мл экстракт плодов аронии Мичурина (× Sorbaronia mitschurinii ) значительно увеличивал медианную ПЖ самцов на 22 %, но при более высоких кон-

Таблица

Влияние экстракта малины на параметры продолжительности жизни особей Drosophila melanogaster

Table

The effect of raspberry extract on the lifespan parameters of Drosophila melanogaster individuals

Вариант	Пол	M (сут)	dM (%)	КС	МК	ГБВ	90% (сут)	d90% (%)	ВА	N
1 повторность
Контроль	d	53	n/a	n/a	n/a	n/a	61	n/a	n/a	156
0,01 мг/мл	d	53	0	p > 0,05	p < 0,05	p < 0,05	64	5	p > 0,05	159
0,1 мг/мл	d	49	-8**	p < 0,05	p < 0,05	p < 0,01	56	-8	p > 0,05	162
1 мг/мл	d	49	-8	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	61	0	p > 0,05	162
2,5 мг/мл	d	50	-6	p > 0,05	p > 0,05	p < 0,05	56	-8*	p < 0,05	157
5 мг/мл	d	53	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	59	-3	p > 0,05	157
Контроль	9	61	n/a	n/a	n/a	n/a	67	n/a	n/a	158
0,01 мг/мл	9	61	0	p > 0,05	p < 0,05	p > 0,05	70	5	p > 0,05	162
0,1 мг/мл	9	61	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	67	0	p > 0,05	162
1 мг/мл	9	57	-7**	p > 0,05	p < 0,01	p < 0,01	64	-5*	p < 0,05	161
2,5 мг/мл	9	57	-7***	p < 0,01	p < 0,001	p < 0,001	64	-5*	p < 0,05	160
5 мг/мл	9	57	-7**	p > 0,05	p < 0,01	p < 0,01	64	-5*	p < 0,05	146
2 повторность
Контроль	d	55	n/a	n/a	n/a	n/a	63	n/a	n/a	167
0,01 мг/мл	d	56	2	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	63	0	p > 0,05	167
0,1 мг/мл	d	56	2	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	63	0	p > 0,05	158
1 мг/мл	d	55	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	63	0	p > 0,05	154
2,5 мг/мл	d	55	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	62	-2	p > 0,05	160
5 мг/мл	d	56	2*	p < 0,05	p < 0,05	p < 0,05	63	0	p > 0,05	164
Контроль	9	64	n/a	n/a	n/a	n/a	71	n/a	n/a	167
0,01 мг/мл	9	63	-2	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	70	-1	p > 0,05	156
0,1 мг/мл	9	66	3	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	72	1	p < 0,05	155
1 мг/мл	9	63	-2	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	70	-1	p > 0,05	156
2,5 мг/мл	9	63	-2***	p < 0,01	p < 0,001	p > 0,05	69	-3*	p < 0,05	162
5 мг/мл	9	63	-2**	p < 0,001	p < 0,01	p > 0,05	69	-3***	p < 0,001	163
3 повторность
Контроль	d	66	n/a	n/a	n/a	n/a	73	n/a	n/a	150
0,01 мг/мл	d	66	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	73	0	p > 0,05	154
0,1 мг/мл	d	61	-8	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	73	0	p > 0,05	147
1 мг/мл	d	66	0	p < 0,01	p > 0,05	p > 0,05	74	1	p < 0,05	157
2,5 мг/мл	d	66	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	73	0	p > 0,05	159
5 мг/мл	d	66	0	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	73	0	p > 0,05	153
Контроль	9	73	n/a	n/a	n/a	n/a	77	n/a	n/a	155
0,01 мг/мл	9	70	-4	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	77	0	p > 0,05	154
0,1 мг/мл	9	70	-4	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	77	0	p > 0,05	158
1 мг/мл	9	70	-4	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	77	0	p > 0,05	158
2,5 мг/мл	9	69	-6**	p < 0,01	p > 0,05	p < 0,01	76	-1	p > 0,05	158
5 мг/мл	9	70	-4	p > 0,05	p > 0,05	p > 0,05	76	-1	p > 0,05	157

Условные обозначения. d - самцы; 9 - самки; М - медианная продолжительность жизни (сут); dM - различия между медианной продолжительностью жизни контрольных и экспериментальных мух (%), 90 % – возраст гибели 90 % особей выборки (сут), d90 % – различия между возрастом гибели 90 % особей в контрольной и экспериментальной выборках (%); N – количество особей в выборке; КС – критерий Колмогорова-Смирнова с учетом поправки Бонферрони; МК – критерий Мантеля-Кокса с учетом поправки Бонферрони; ГБВ – критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона с учетом поправки Бонфер-рони; ВА – тест Ванг-Аллисона с учетом поправки Бонферрони; n/a – не применимо.

Keys. d - males; 9 - females; M - median life expectancy (days); dM - differences between the median life expectancy of control and experimental flies (%); 90 % – age of death of 90 % of individuals in the sample (days); d90 % – differences between the age of death of 90 % of individuals in the control and experimental samples (%); N – number of individuals in the sample; KС – Kolmogorov-Smirnov test with Bonferroni correction; MK – Mantel-Cox criterion with Bonferroni correction; ГБВ – Gehan-Breslow-Wilcoxon criterion with Bonferroni correction; ВA – Wang-Allison test with Bonferroni correction; n/a – not applicable.

центрациях (1 и 5 мг/мл) наблюдалось резкое сокращение медианной и максимальной продолжительности жизни на 14 и 33 % соответственно у линии Drosophila melanogaster с моделью бокового амиотрофического склероза [14]. В подобном эксперименте, с применением экстракта пло- дов аронии Мичурина (×Sorbaronia mitschurinii), при кратковременном (на протяжении двух недель, во взрослом возрасте (4-6 неделя жизни)) применении экстракта был обнаружен статистически значимый положительный эффект на медианную (до 5 %) и максимальную (до 9 %) про- должительность жизни самцов Drosophila melanogaster [38]. Вышеописанные эффекты демонстрируют зависимость от таких показателей, как возраст и пол особи, концентрация и длительность использования экстракта.

Таким образом, снижение продолжительности жизни D. melanogaster под действием экстракта ягод малины прежде всего обусловлено длительностью его использования (на протяжении всей жизни) и высокими концентрациями. Вероятно, при больших дозах антиоксидантов происходят перегрузка антиоксидантной системы и активация прооксидантного действия полифенолов. Высокие дозы антиоксидантных добавок могут нарушить клеточный гомеостаз, чрезмерно снижая уровень активных форм кислорода [30, 39]. Кроме того, эллагитанины, несмотря на доказанные полезные свойства, при чрезмерном накоплении способны вызывать цитотоксический эффект и отрицательно влиять на жизнеспособность. Ранее было показано, что эллаготанины, выделенные из малины, вызывают значительные повреждения ДНК при концентрациях от 2,5 до 160 мкг/мл, вызывая от 7,3 до 56,8 % ДНК-повреждений [40].

Полученные нами результаты и литературные данные указывают на сложный контекст воздействия растительных экстрактов на такой интегральный показатель, как продолжительность жизни. Доза и режим кормления важны, так как постоянное поступление большого количества биологически активных веществ может накапливаться и проявлять токсический эффект или вызывать аллергическую реакцию, а кратковременное применение умеренных доз – оказывать полезное воздействие на организм [41]. Состав экстракта также играет роль: наряду с полезными антоцианами и флавоноидами он содержит разные фенольные соединения, часть из которых может усиливать окислительный стресс при избыточном накоплении. По данным литературы, в настоящий момент эффекты применения экстрактов плодов малины обыкновенной на модельных организмах in vitro и in vivo мало изучены, поэтому необходимы дальнейшие исследования с измененным дизайном кормления дрозофил и дополнительными тестами для всесторонего рассмотрения геропротектор-ного потенциала.

Заключение

Таким образом, в нашем исследовании мы обнаружили, что добавляемый в питательную среду на протяжении всей жизни этанольный экстракт плодов малины обыкновенной ( Rubus idaeus L.) оказывает негативный эффект на продолжительность жизни как самцов, так и самок Drosophila melanogaster .

Для того чтобы всесторонне изучить геропротектор-ный потенциал экстракта ягод малины, необходимы дальнейшие исследования эффектов применения экстракта на показатели жизнеспособности (выживаемость в неблагоприятных условия окружающей среды, проницаемость кишечного барьера в различном возрасте) Drosophila melanogaster .