Влияние экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного на устойчивость бактерий Escherichia coli к пероксидному стрессу

чевое, гематопротекторное, стресс-протекторное, нейротропное, противодиабетическое и гиполипи-демическое действие Серпистена [2]. В то же время необходимы дополнительные исследования фито-экдистероидов, чтобы подтвердить их безвредность для человека. С этой точки зрения представляется актуальным исследование влияния экдистероидсо-держащих субстанций на микробиоту человека, которая в последние годы рассматривается как полноценный орган, выполняющий важные метаболические функции. Целью данной работы являлось изучение влияния экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного, а также субстанции Серпи-стен на экспрессию стрессовых регулонов и устойчивость к пероксидному стрессу у обычного обитателя кишечника бактерии E. coli .

Используемые в работе штаммы E. coli NM3021 ( katG::lacZ ), NM3041 ( rpoS::lacZ ) и NM3031 ( katE::lacZ ) созданы на основе штамма BW25113 (дикий тип) путем трансформации плазмид pKT1033 ( katG::lacZ ) (получена в дар от К. Тао, Япония), pRS415 katF 5 ( rpoS::lacZ ) и pRS katE 16 ( katE::lacZ ) (дар проф. А.Эйзенштарка, США), несущих слияния промоторов изучаемых генов со структурным геном β-галактозидазы. Штамм NM3001 ( sodA::lacZ ) сконструирован путем трансдукции фагом P1 хромосомного слияния sodA::lacZ из штамма QC772 (проф. Д. Тоуати, Франция) в штамм BW25113. Бактерии выращивали на среде М9 с добавлением 2 г/л глюкозы, 0.2% казамино-вых кислот и 10 мкг/мл тиамина. За ростом бактерий следили путем измерения оптической плотности культуры при длине волны 600 нм.

Устойчивость бактерий к пероксидному стрессу определяли следующим образом. Ночную культуру выращивали в термостате при 37°С. Клетки из ночной культуры центрифугировали и переносили в колбы объемом 250 мл, содержащие 100 мл среды М9, до начальной OD600=0.1 и выращивали на качалках при скорости вращения 140 об/мин и температуре 37°С до OD600=0.6. Далее культуру центрифугировали и ресуспендировали в 8 мл среды M9. В ячейки иммунологического планшета добавляли по 5 мкл исследуемых экстрактов, 5 мкл концентрированных клеток (до конечной OD600=0.1) и среду M9 до общего объема 200 мкл. OD600 измеряли до и после добавления клеток, чтобы учесть цветность экстракта. Планшеты культивировали на качалках (140 об/мин, температура 37°С) 20 мин, измеряли OD600 и в опытные ячейки вносили Н2 О2 до концентрации 0.1 мМ и 4 мМ. Культивирование продолжали в течение 30 мин, после чего измеряли OD600 на микропланшетном спектрофотометре BioRad xMark. Удельную скорость роста (µ) рассчитывали по формуле µ = ln (N1 ⁄N0) ⁄ t1-t0, где N0 и N1 – оптическая плотность культуры во время t0 и t1, соответственно.

Уровень экспрессии генов определяли путем измерения активности β-галактозидазы в штаммах, несущих слияния с геном lacZ . Активность β-галактозидазы измеряли по методу Миллера [3], модифицированному для иммунологических планшетов [4]. Также определяли радикалсвязывающую активность [5], металл-хелатирующую способность экстрактов [6] и содержание полифенолов в испытуемых экстрактах [7].

Результаты экспериментов по влиянию исследуемых субстанций на экспрессию стрессовых генов и устойчивость бактерий к пероксидному стрессу представлены в таблице 1.

Все экстракты и Серпистен при концентрации в среде культивирования 0.4 мг и 0.1 мг сухого вещества на 1 мл среды, соответственно, не оказывали существенного влияния на скорость роста бактерий. Исключение составлял экстракт пажитника сенного, который в трех штаммах из четырех изученных ингибировал рост на 20%. Присутствие экстрактов серпухи и пажитника в среде культивирования приводило к 1.5-2-кратному повышению уровня экспрессии генов katG и sodA, кодирующих каталазу-гидропероксидазу I и Mn-супер-оксиддисмутазу, соответственно. Серпистен также повышал экспрессию генов katG в 1.6 раза и sodA в 1.3 раза. Экстракты серпухи и Серпистен не оказывали существенного влияния на экспрессию генов rpoS и katE. Экстракт пажитника индуцировал экспрессию гена rpoS в 1.24 раза и гена katE – в 1.37 раза. Ген rpoS кодирует σS субъединицу РНК-полимеразы (RpoS), которая контролирует экспрессию большого числа генов общего стрессового ответа, индуцируется при замедлении роста и обеспечивает устойчивость ко многим стрессам. Ген katE находится под контролем RpoS и кодирует гидропероксидазу II. Индукция rpoS и katE в присутст- вии экстракта пажитника может быть связана с его ингибирующим влиянием на рост бактерий, которое наблюдалось в наших экспериментах.

Внесение перекиси водорода в среду культивирования сопровождается полной остановкой роста бактерий, возобновление роста происходит при снижении концентрации пероксида в среде под действием внутриклеточных каталаз. Величина удельной скорости роста бактерий через 30 мин экспозиции к Н 2 О 2 может служить мерой устойчивости бактерий к пероксидному стрессу [8, 9]. Предобработка бактериальных культур всех изученных штаммов экстрактами серпухи и пажитника до добавления 4 мМ Н 2 О 2 приводила к 2-3-кратному возрастанию скорости роста по сравнению с культурой, предобработанной диметилсульфоксидом, который использовался в качестве растворителя для экстрактов. Таким образом, экстракты проявляли адаптогенное действие, повышая устойчивость бактерий к перекиси водорода. Серпистен в изученной концентрации не оказывал защитного влияния на рост бактерий.

Ген katG индуцируется в ответ на повышение концентрации эндогенной и экзогенной перекиси водорода. В наших экспериментах внесение Н 2 О 2 в среду приводило к повышению экспрессии гена katG , как в контрольной культуре, так и в культурах, предобработанных исследуемыми субстанциями. Причем в культурах, предобработанных экстрактами, экспрессия katG была значительно выше, чем в культурах, предобработанных Серпи-стеном. Экспрессия гена katE , кодирующего гидропероксидазу II, после внесения Н 2 О 2 возрастала примерно одинаково и в контрольной, и во всех опытных культурах. Следовательно, повышенный уровень каталазы-гидропероксидазы I, кодируемой геном katG , может быть одной из основных причин защитного действия экстрактов при пероксидном стрессе.

Ранее мы показали, что растительные полифенолы защищают бактерии E. coli от пероксидного стресса благодаря повышению экспрессии гена katG и, соответственно, активности каталазы HPI [10]. Механизм действия полифенолов включал как их прооксидантные эффекты (способность к аутоокислению с образованием Н 2 О 2 ), так и способность хелатировать внутриклеточное железо, уменьшая производство токсичных гидроксильных радикалов. Продукция низких доз Н 2 О 2 при аутоокислении полифенолов способствует развитию адаптивного ответа, который снижает повреждающее действие перекиси водорода при последующем добавлении ее более высокой дозы. Мы измерили уровни полифенолов, а также радикалсвязываю-щую и хелатирующую активность экстрактов и Серпистена (табл. 2).

Таблица 1. Влияние исследуемых субстанций на экспрессию стрессовых генов и устойчивость бактерий E. coli к действию 4 мМ Н 2 О 2

Штамм и условия	Контроль (ДМСО)		S. coronata (1S)		S. coronata (2S)		Trigonella foenum-graecum		Серпистен
	-1 µ, час	β-галактозидаза	-1 µ, час	β-галактозидаза	-1 µ, час	β-галактозидаза	-1 µ, час	β-галактозидаза	-1 µ, час	β-галактозидаза
katG::lacZ до Н 2 О 2	0.94±0.0 5	109 ±14(1.0)	0.91±0.0 4	171 ±11 *(1.57)	0.93±0.0 3	157 ±16(1.44)	1.0±0.05	229 ±18*(2.1)	0.93±0.0 3	171 ±12 *(1.57)
katG::lacZ 30 мин после Н 2 О 2	0.29 ±0.04 (1.0)	177±22	0.59 ±0.04 *(2.03)	411±44*	0.54 ±0.05 *(1.86)	398±36*	0.55 ±0.03 *(1.9)	383±30*	0.27±0.0 4 (0.93)	285±46
sodA::lacZ до Н 2 О 2	0.97±0.0 4	104 ±5(1.0)	0.98±0.0 3	209 ±20*(2.0)	0.99±0.0 4	161 ±9*(1.54)	0.73±0.0 3	197 ±15 *(1.89)	0.93±0.0 6	136 ±7*(1.31)
sodA::lacZ 30 мин после Н 2 О 2	0.31 ±0.02 (1.0)	280±18	0.75±0.0 4*(2.42)	406±34*	0.61 ±0.04 *(1.97)	367±13*	0.63 ±0.04 *(2.03)	457±26*	0.39 ±0.03 (1.26)	299±22
rpoS::lacZ до Н 2 О 2	0.88±0.0 3	330±19	0.94±0.0 6	381±30	0.79±0.0 6	378±41	0.72±0.0 3	408±45	0.75±0.0 7	403±38
rpoS::lacZ 30 мин после Н 2 О 2	0.18 ±0.02 (1.0)	535±20	0.67 ±0.04 *(3.72)	410±23*	0.59 ±0.07 *(3.28)	367±26*	0.61 ±0.02 *(3.39)	391±29*	0.18 ±0.02 (1.0)	508±23
katE::lacZ до Н 2 О 2	0.93±0.0 3	693±29	0.93±0.0 3	752±43	1.0±0.03	747±60	0.77±0.0 2	950±100 *	0.93±0.0 2	702±54
katE::lacZ 30 мин после Н 2 О 2	0.29 ±0.02 (1.0)	1102±35	0.66 ±0.02 *(2.28)	1046±80	0.56 ±0.04 *(1.93)	1119±90	0.45 ±0.04 *(1.55)	1208±66	0.32 ±0.03 (1.1)	1171±71

Прим. Культуры E. coli NM3021 ( katG::lacZ ), NM3001 ( sodA::lacZ ), NM3041 ( rpoS::lacZ ) и NM3031 ( katE::lacZ ) выращивали 20 мин в присутствии ДМСО или исследуемых субстанций, а затем обрабатывали 4 мМ перекиси водорода. Степень защитного действия субстанций оценивали по скорости роста бактерий через 30 мин после добавления Н 2 О 2 . Уровень экспрессии генов определяли по активности β-галактозидазы в штаммах, несущих слияние промотора исследуемого гена со структурным геном β-галактозидазы. В скобках представлены отношения величин удельной скорости роста или активности β-галактозидазы в присутствии субстанций к контрольным значениям. Статистически значимые отличия отмечены звездочкой.

Таблица 2. Содержание полифенолов, радикалсвязывающая (по DPPH) и хелатирующая активность в исследуемых субстанциях

Экстракты	Полифенолы мкг/мг сух. экстракта	Связывание DPPH %	Хелатирование %
S. coronate (1S)	17.5 ± 0.2	52 ± 3	7 ± 0.1
S. coronate (2S)	14.4 ± 0.4	38 ± 2	33 ± 5
T. foenum-graecum	28.2 ± 0.2	53 ± 2	45.5 ± 1.7
Серпистен	6.3 ± 0.2	1.4 ± 0.5	0

Прим. 25 мг сухого экстракта растворяли в 1.5 мл ДМСО.

Для определения полифенолов использовали 10 мкл этих растворов.

Для определения хелатирующей способности - 60 мкл этих растворов.

Для определения радикалсвязывающей активности (по DPPH) – 100 мкл этих растворов.

Значения для полифенолов приведены в эквивалентах галловой кислоты.

Экстракты содержали значительное количество полифенолов и существенно превышали Серпистен по способности к связыванию радикалов DPPH и хелатированию железа. В целом протекторное действие экстрактов серпухи и пажитника при перок-сидном стрессе у бактерий E. coli может быть в большей степени связано с содержанием полифенолов, чем экдистероидов, что согласуется с ранее полученными данными [11]. Авторы цитируемой работы показали, что флавоноидсодержащая фракция экстракта S. coronata была более эффективна в качестве антиоксиданта при перекисном окислении липидов, чем экдистероидсодержащая фракция. Вместе с тем известно, что экдистероиды могут проявлять антиоксидантные свойства, снижая перекисное окисление липидов у крыс и повышая ак- тивность ферментов антиоксидантной защиты организма - каталазы и супроксиддисмутазы [12]. Интересно, что, несмотря на различия в используемой модели (бактерии и крысы), мы также наблюдали повышение экспрессии генов, кодирующих каталазу и супероксиддисмутазу при обработке бактерий Серпистеном. 20-гидроксиэкдизон в 1.33 раза повышал экспрессию гена katG, но не индуцировал экспрессию гена sodA. Механизмы повышения экспрессии антиоксидантных генов при действии эк-дистероидов нуждаются в дальнейших исследованиях.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, соглашение 8114, гранта Президента РФ МК-1763.2012.4 для молодых ученых, а также гранта №12-И-4-2072 по Программе интеграционных проектов Президиума УрО РАН.

• 1.    Lafont R. Recent Progress in Ecdysteroid Pharmacology // Теор. прикл. экология. 2012. № 1. С. 6-12.

• 2.    Володин В.В. , Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения – источники новых адаптогенов // Вест. биотех. физ-хим. биологии. 2011. Т. 7. № 2. С. 52-59.

• 3.    Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics . New York: Cold Spring Harbor. 1972.

• 4.    Smirnova G., Samoilova Z., Muzyka N., Oktyabrsky O. Influence of plant polyphenols and medicinal plant extracts on antibiotic susceptibility of Escherichia coli // J. Appl. Microbiol. 2012. V. 113. P. 192-199.

• 5.    Kim H.-J., Chen F., Wang X., Chung H.Y., Jin Z. Evaluation of antioxidant activity of vetiver ( Vetiveria zizanioides L . ) oil and identification of its antioxidant constituents // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. P. 7691-7695.

• 6.    Shyur L.-F. Tsung J.-H., Chen J.-H., Chiu C.-Y., Lo C.-P. Antioxidant properties of extracts from medicinal plants popularly used in Taiwan // Int. J. Appl. Sci. Eng. 2005. V. 3. P. 195-202.

• 7.    Wu L.-C., Hsu H.-W., Chen Y.-C., Chin C.-C., Lin Y.-I., Ho J.A. Antioxidant and antiproliferative activities of red pitaya // Food Chem. 2006. V. 95. P. 319-327.

• 8.    Smirnova G.V., Vysochina G.I., Muzyka N.G., Samoylova Z.Y., Kukushkina T.A, Oktyabrsky O.N. Evaluation of antioxidant properties of medicinal plants using microbial test systems // World J. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 26. P. 2269-2276.

• 9.    Oktyabrsky O., Vysochina G., Muzyka N., Samoilova Z., Kukushkina T., Smirnova G. Assessment of antioxidant activity of plant extracts using microbial test systems // J. Appl. Microbiol. 2009. V. 106. P. 1175-1183.

• 10.    Smirnova G.V., Samoylova Z.Y., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. V. 46. P. 759768.

• 11.    Baґthoria M., Zupkoґb I., Hunyadia A., Gaґcsneґ-Baitzc E., Dinyac Z., Forgoґd P. Monitoring the antioxidant activity of extracts originated from various Serratula species and isolation of flavonoids from Serratula coronata // Fitoterapia. 2004. V. 75. P. 162-167.

• 12.    Хушбактова З.А., Царук А.В., Гукасов В.М., Сыров В.Н. Экспериментальная оценка действия фитоэкдистерои-дов на процессы перекисного окисления липидов печени крыс при проведении опытов in vitro и in vivo // Теор. прикл. экология. 2012. № 1. С. 31-34.

THE INFLUENCE OF SERRATULA CORONATA AND TRIGONELLA FOENUM - GRAECUM EXTRACTS ON RESISTANCE OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI

TO PEROXIDE STRESS

1Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural branch of RAS, Perm 2 Institute of Biology, Komi Sci. Centre, Ural branch of RAS, Syktyvkar

The influence of Serratula coronata and Trigonella foenum-graecum extracts and ecdisteroid-containing substance Serpisten on stress gene expression and resistance of bacteria E. coli to action of hydrogen peroxide was investigated. All the substances studied were shown to increase expression of antioxidant genes katG and sodA, encoding catalase-hydroperoxidase I and Mn-superoxidedismutase, respectively. The extracts of S. coronata and T. foenum-graecum protected bacteria against bacteriostatic doses of hydrogen peroxide, while Serpisten did not affect bacterial resistance to peroxide stress. Apparently, the observed protection was due to the extracts’ content of polyphenols which demonstrated radical-scavenging, metal-chelating and prooxidant activities.