Влияние кадмия на интенсивность липопероксидации и адаптационный потенциал организма

Введение. Кадмий – распространенный экотоксикант из группы тяжелых металлов. Основными природными источниками кадмия являются месторождения цинковых руд, осадочные и вулканические породы. Как побочный продукт кадмий выделяется при производ- стве аккумуляторов, пластмасс, лакокрасочных изделий, эксплуатации производственного оборудования, автомобилей. В окружающей среде кадмий накапливается в почве, с током вод попадает в водоемы. Кадмий концентрируется в вегетативных и генеративных частях растений, с растительным кормом и водой попадает в организм сельскохозяйственных животных. Помимо продуктов питания, в организм человека кадмий также поступает при курении сигарет и вдыхании загрязненного воздуха производственных цехов, промзон, автострад [1].

Попадая в организм, кадмий способствует развитию окислительного стресса – состояния прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса организма, которое ведет к нарушению работы и гибели клеток [2]. Окислительный стресс возникает из-за увеличения продукции свободных радикалов и истощения антиоксидантных ресурсов организма [3, 4]. При пероральном поступлении в организм кадмий связывается с транспортными белками металло-тионеинами, поступает в печень, где накапливается в гепатоцитах, затем с током крови переносится в почки и в некоторой степени выводится с мочой. Период полувыведения кадмия из организма продолжителен и может составлять до 35 лет. Это связано с его способностью накапливаться в органах, при этом основными мишенями становятся печень и почки как основные органы детоксикации и выведения [1, 5–7].

В клетках основной мишенью токсического действия кадмия является митохондриальный комплекс III цепи переноса электронов. При этом увеличивается продукция свободных радикалов в виде активных форм кислорода (АФК) [8]. Повышение уровня АФК способствует повреждению липидов клетки и интенсифицирует процессы перекисного окисления. О степени повреждения клеток можно судить по динамике содержания первичных (диеновые (ДК) и триеновые конъюгаты (ТК)) и вторичных (малоновый диальдегид (МДА)) продуктов перекисного окисления липидов, а также концентрации конечных продуктов (Шиффовы основания (ШО)), которые образуются при глубоком повреждении структур клеток и вовлечении белков в процессы перекисного окисления в клетке [9–13]. При воздействии кадмия на фолдинг белков синтез ферментов антиоксидантной системы может нарушаться, что дополни- тельно снижает способность организма поддерживать прооксидантно-антиоксидантный баланс [2, 3].

Кадмий может воздействовать на человека в небольших дозах повседневно. В норме адаптационные способности организма постепенно нормализуют нарушенные процессы и восстанавливают баланс. Однако механизмы негативного влияния кадмия и продолжительный период полувыведения позволяют предположить невозможность полноценного восстановления функционирования организма даже после прекращения поступления токсиканта.

Цель исследования. Изучение влияния субхронической интоксикации кадмием на уровень АФК, процессы липопероксидации, а также адаптационные возможности организма в постинтоксикационный период.

Материалы и методы . Эксперимент проводили на 100 здоровых самцах крыс линии «Вистар» массой тела 220–230 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария на базе экспериментально-биологической клиники ФГБОУ ВО КГМУ в осенне-зимний период [14]. Случайным образом крысы были разделены на 10 групп по 10 особей в каждой. Животные групп контроля (К7, К14, К21, К28, К56 (индексы соответствуют дню выведения из эксперимента)) содержались на стандартном рационе со свободным доступом к чистой питьевой воде. Крысы группы интоксикации (Cd7, Cd14, Cd21, Cd28, Cdст) получали вместо питьевой воды раствор кадмия ацетата (концентрация – 0,096 г/л, доза – 1/50 LD 50 (LD 50 =360 мг/кг) [15]. Группу Cdст после 28 дней поступления раствора кадмия переводили на стандартный рацион с чистой питьевой водой в течение последующих 28 дней для изучения способности организма к восстановлению за счет собственных адаптивных ресурсов.

Крыс выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации [16, 17]. Для исследования использовали плазму и гомогенаты печени и почек. Кровь забирали из правого желудочка сердца, центрифугировали при 3000 об./мин (Eppendorf Minispin, Германия) для получения плазмы. Для приго- товления гомогенатов органы промывали физиологическим раствором, брали навеску и измельчали пестиковым гомогенизатором (DWK Life Sciences, Германия) в присутствии 0,1 М Трис-KCl буферного раствора с рН=7,35 в соотношении «ткань – буфер» 1:10.

Содержание АФК определяли с помощью флуориметрии (планшетный анализатор Varioscan Flash, Thermo Fisher Scientific, США; набор OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Green Fluorescence), Cell Biolabs, США). Принцип метода состоит во взаимодействии проб или стандарта ROS (H 2 O 2 ) с катализатором в лунке, после инкубации в лунки вносили зонд DCFH, затем проводили флуо-риметрическое измерение при длине волны возбуждения 480 нм и длине волны эмиссии 530 нм. Концентрацию выражали в мкмоль/л.

Уровни МДА, ДК, ТК и ШО оценивали спектрофотометрически (спектрофотометр BioRad SmartSpec Plus, США).

Изучение концентрации МДА проводили путем осаждения белков трихлоруксусной кислотой с последующим добавлением тиоб-арбитуровой кислоты, нагреванием на водяной бане до получения окрашенного продукта реакции, содержание которого пропорционально уровню МДА. Оптическую плотность измеряли при длине волны 535±5 нм. Для расчета использовали малярный коэффициент поглощения окрашенного продукта (ε=1,56×105 [М^{– 1} ×см^{– 1} ]). Концентрацию выражали в нмоль/л [18].

Определение содержания ДК, ТК и ШО проводили экстракцией продуктов окисления из исследуемого образца смесью гептан-изо-пропанол (1:1) [19]. К полученным пробам приливали 0,01 Н раствор соляной кислоты для разделения фаз экстрагентов. Отбирали аликвоты из гептанового слоя и измеряли оптические плотности при длине волн 220, 232, 278 и 400 нм (максимумы поглощения диеновых, триеновых конъюгатов и ШО соответственно). Концентрацию выражали в условных единицах (у.е.).

Полученные данные анализировали с использованием программы STATISTICA 13.0. Проверку гипотезы о нормальном распределе- нии количественных показателей осуществляли с помощью критерия Шапиро – Уилка. Поскольку большинство данных не подчинялось нормальному распределению, количественные показатели представлены в виде медианы и значений нижнего и верхнего квартилей (Me [Q1–Q3]). Для сравнения двух независимых выборок использовали непараметрический U-критерий Манна – Уитни. Различия показателей двух групп считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение . В контрольных группах показатель АФК незначительно варьировал в пределах 120,23–127,78 мкмоль/л в печени, 109,21–112,14 мкмоль/л в почках, 0,25– 0,27 мкмоль/л в плазме, что свидетельствует о стабильном окислительном гомеостазе и нормальном функционировании антиоксидантной системы (табл. 1). При поступлении кадмия ацетата в дозе 1/50 LD50 уже на 7-й день эксперимента наблюдается статистически значимый рост продукции АФК в печени, почках и плазме, который продолжается в течение всех 28 дней. Изменение показателя может быть обусловлено активным влиянием кадмия на митохондрии и утечкой электронов в цепи переноса электронов митохондрий. В то же время поступление кадмия приводит к дисбалансу свободно-радикального гомеостаза организма.

Когда способность организма поддерживать нормальный уровень АФК снижается, радикалы начинают повреждать липиды клеточной мембраны. В группах контроля (К7–К28) уровень ДК варьировал незначительно (IQRпечень 0,31–0,33, IQRпочки 0,01–0,03, IQRплазма0,10–0,21), как и уровень ТК (IQRпечень 0,24–0,25, IQRпочки 0,01–0,02, IQRплазма 0,08–0,12) (табл. 1). Дисбаланс приводит к интенсификации окислительного повреждения липидов, о чем свидетельствует статистически значимое увеличение уровня ДК в печени, почках и плазме на протяжении всей интоксикации c 7-го по 28-й день. На 7-й день поступления кадмия ацетата отмечается увеличение концентрации ТК в почках, на 14-й день – в печени и плазме. К 28-му дню эксперимента повышенное содержание остается значимым в печени и почках. В плазме уровень ТК снижа- ется до уровня контроля. Это можно объяснить переходом первичных продуктов во вторичные и взаимодействием с белковыми моле- кулами. Также ТК могут участвовать в модификации белков, переходить в токсичные продукты и утилизироваться [18].

Таблица 1

Table 1

Динамика содержания активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов при субхронической интоксикации кадмием

Dynamics of reactive oxygen species and lipid peroxidation products during subchronic cadmium intoxication

Среда Sample type	Продолжительность воздействия, дней Exposure duration, days
	7		14		21		28
	К	Cd	К	Cd	К	Cd	К	Cd
Активные формы кислорода, мкмоль/л Reactive oxygen species, µmol/L
Печень Liver	122,47 [106,83– 135,89]	143,81 [136,69– 156,13]	124,46 [106,61– 134,50]	176,39 [154,89– 193,89]	120,23 [109,38– 136,17]	208,90 [189,43– 229,58]	127,78 [108,19– 133,34]	234,98 [209,06– 257,68]
	p=0,000000		p=0,000000		p=0,000000		p=0,000000
Почки Kidney	111,23 [104,54– 115,88]	140,65 [127,09– 146,94]	112,14 [98,37– 121,21]	145,07 [128,69– 146,90]	111,03 [98,80– 117,00]	165,83 [160,00– 174,60]	109,21 [97,59– 119,33]	203,06 [194,63– 216,36]
	p=0,000246		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183
Плазма Plasma	0,26 [0,20– 0,32]	0,43 [0,41– 0,48]	0,26 [0,22– 0,31]	0,50 [0,48– 0,54]	0,27 [0,23– 0,31]	0,84 [0,82– 0,90]	0,25 [0,21– 0,33]	1,09 [1,07– 1,27]
	p=0,001706		p=0,000182		p=0,000183		p=0,000183
Малоновый диальдегид, нмоль/л Malondialdehyde, nmol/L
Печень Liver	41,34 [35,67– 45,97]	58,10 [47,43– 68,54]	42,70 [36,53– 50,65]	90,38 [56,71– 112,62]	42,51 [37,12– 48,60]	104,65 [84,10– 124,49]	42,94 [36,77– 47,88]	107,00 [87,62– 154,11]
	p=0,000000		p=0,000000		p=0,000000		p=0,000000
Почки Kidney	59,28 [57,02– 62,05]	95,34 [92,15– 98,44]	60,36 [56,74– 66,13]	110,39 [104,18– 120,00]	63,90 [59,05– 66,54]	121,56 [112,36– 135,82]	62,03 [56,71– 65,90]	142,74 [127,96– 147,73]
	p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183
Плазма Plasma	35,83 [33,19– 40,20]	45,41 [41,45– 50,21]	36,97 [35,20– 41,16]	59,67 [57,65– 65,57]	37,17 [33,59– 39,31]	96,83 [90,96– 106,84]	38,16 [34,29– 39,49]	121,50 [106,92– 131,45]
	p=0,002827		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183
Диеновые конъюгаты, у.е. Diene conjugates, au
Печень Liver	0,76 [0,55– 0,87]	0,85 [0,74– 0,97]	0,76 [0,56– 0,87]	0,98 [0,84– 1,16]	0,77 [0,55– 0,86]	1,19 [0,93– 1,29]	0,78 [0,53– 0,86]	1,25 [1,15– 1,40]
	p=0,000232		p=0,000000		p=0,000000		p=0,000000

Среда Sample type	Продолжительность воздействия, дней Exposure duration, days
	7		14		21		28
	К	Cd	К	Cd	К	Cd	К	Cd
Почки Kidney	0,19 [0,19– 0,20]	0,27 [0,27– 0,28]	0,19 [0,18– 0,20]	0,48 [0,40– 0,49]	0,19 [0,17– 0,20]	0,64 [0,61– 0,72]	0,19 [0,18– 0,20]	0,78 [0,69– 0,87]
	p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183
Плазма Plasma	1,05 [1,03– 1,13]	1,24 [1,14– 1,34]	1,05 [0,96– 1,10]	1,63 [1,50– 1,80]	1,06 [0,95– 1,11]	1,53 [1,50– 1,57]	1,04 [0,92– 1,13]	1,24 [1,21– 1,28]
	p=0,0017063		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000583
Триеновые конъюгаты, у.е. Triene conjugates, au
Печень Liver	0,60 [0,45– 0,70]	0,64 [0,47– 0,78]	0,62 [0,45– 0,69]	0,65 [0,48– 0,83]	0,62 [0,45– 0,70]	0,79 [0,69– 1,01]	0,60 [0,45– 0,69]	0,98 [0,91– 1,09]
	p=0,132651		p=0,030788		p=0,000000		p=0,000000
Почки Kidney	0,06 [0,05– 0,07]	0,26 [0,25– 0,28]	0,06 [0,05– 0,06]	0,33 [0,29– 0,35]	0,06 [0,05– 0,06]	0,37 [0,36– 0,39]	0,06 [0,05– 0,06]	0,45 [0,39– 0,46]
	p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183
Плазма Plasma	0,85 [0,82– 0,92]	0,94 [0,89– 1,03]	0,85 [0,80– 0,92]	1,12 [1,05– 1,22]	0,86 [0,80– 0,91]	0,97 [0,93– 1,08]	0,85 [0,81– 0,89]	0,88 [0,74– 0,93]
	p=0,025749		p=0,000183		p=0,002202		p=0,909722
Шиффовы основания, у.е. Schiff bases, au
Печень Liver	0,27 [0,22– 0,32]	0,33 [0,27– 0,40]	0,27 [0,22– 0,31]	0,55 [0,33– 0,72]	0,27 [0,22– 0,32]	0,66 [0,57– 0,76]	0,26 [0,22– 0,30]	0,61 [0,57– 0,69]
	p=0,000021		p=0,000000		p=0,000000		p=0,000000
Почки Kidney	0,010 [0,009– 0,011]	0,121 [0,105– 0,129]	0,010 [0,009– 0,011]	0,304 [0,285– 0,320]	0,010 [0,009– 0,010]	0,256 [0,226– 0,273]	0,010 [0,009– 0,011]	0,182 [0,163– 0,199]
	p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183
Плазма Plasma	0,14 [0,13– 0,15]	0,35 [0,34– 0,36]	0,14 [0,13– 0,15]	0,44 [0,41– 0,46]	0,14 [0,12– 0,16]	0,52 [0,50– 0,57]	0,14 [0,13– 0,15]	0,59 [0,52– 0,62]
	p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183		p=0,000183

Примечание. К – контрольные группы, Cd – группы интоксикации.

Note. K – control groups; Cd – intoxication groups.

Когда способность организма поддерживать нормальный уровень АФК снижается, радикалы начинают повреждать липиды клеточной мембраны. В группах контроля (К7–К28) уровень ДК

варьировал незначительно (IQR печень 0,31–0,33, IQR почки 0,01–0,03, IQR плазма 0,10–0,21), как и уровень ТК (IQR печень 0,24–0,25, IQR почки 0,01–0,02, IQR плазма 0,08–0,12) (табл. 1). Дисбаланс приво-

дит к интенсификации окислительного повреде-ния липидов, о чем свидетельствует статистически значимое увеличение уровня ДК в печени, почках и плазме на протяжении всей интоксикации c 7-го по 28-й день. На 7-й день поступления кадмия ацетата отмечается увеличение концентрации ТК в почках, на 14-й день – в печени и плазме. К 28-му дню повышенное содержание остается значимым в печени и почках. В плазме уровень ТК снижатся до уровня контроля. Это можно объяснить переходом первичных продуктов во вторичные и взаимодействием с белковыми молекулами. Также ТК могут участвовать в модификации белков, переходить в токсичные продукты и утилизироваться [18].

Уровень вторичных продуктов перекисного окисления липидов закономерно растет. При субхроническом поступлении кадмия ацетата статистически значимое повышение содержания МДА отмечено с 7-го дня интоксикации (табл. 1). Наибольшее варьирование наблюдается в почках на 21-й день (IQR почки 6,29–23,46), в печени и плазме – на 28-й день (IQR печень 21,11–66,49, IQR плазма 7,92–24,53). Вероятно, к этому моменту наблюдается пик перехода первичных продуктов окисления во вторичные и ослабление способности организма к ферментативному метаболизму МДА. Высокая способность МДА вступать в реакции с биомолекулами и его накопление в клетке становятся причиной вовлечения белков в процессы пероксидации [20].

Значимое увеличение концентрации ШО при субхронической кадмиевой интоксикации статистически наблюдается в течение всех 28 дней эксперимента (табл. 1). В группах контроля их уровень варьировал незначительно (IQR печень 0,08–0,10, IQR почки 0,001–0,002, IQR плазма 0,02–0,04). Во время экспозиции в почках показатель достигает максимума на 21-й день (IQR почки 0,024–0,047), в печени – на 14-й день (IQR печень 0,12–0,39). Вероятно, это может быть связано с критическими моментами вовлечения белков в окислительные процессы в данных органах. В плазме содержание ШО стабильно увеличивается с 7-го дня, на 28-й день достигая 0,59 у.е. и максимального варьирования (IQR плазма 0,02–0,10).

Была изучена способность организма к восстановлению после субхронической интоксикации (группа Cdст) (табл. 2). Содержание АФК в печени и почках снижалось в сравнении с группой интоксикации 28-го дня (Cd28) в 1,46 и 1,58 раза соответственно. Несмотря на это уровень группы контроля (К56) достигнут не был, различия остаются статистически значимыми. В плазме снижение уровня АФК не наблюдается, показатель группы Cdст в 4,4 раза превышает показатель контрольной группы. Это свидетельствует о продолжении процессов свободнорадикального окисления в организме при прекращении поступления токсиканта.

Таблица 2

Table 2

Динамика содержания активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов в постинтоксикационный период

Dynamics of reactive oxygen species and lipid peroxidation products during the post-intoxication period

Среда Sample type	Группа Group
	К56	Cdст		Cd28
Активные формы кислорода, мкмоль/л Reactive oxygen species, µmol/L
Печень Liver	124,54 [108,94–134,62]	161,23 [147,41–200,64]		234,98 [209,06–257,68]
	p=0,000000		p=0,000000
Почки Kidney	110,02 [100,52–121,81]	128,16 [124,57–135,84]		203,06 [194,63–216,36]

Среда Sample type	Группа Group
	К56	Cdст		Cd28
	p=0,002202		p=0,000183
Плазма Plasma	0,25 [0,22–0,33]	1,10 [1,05–1,19]		1,09 [1,07–1,27]
	p=0,000183		p=0,677585
Малоновый диальдегид, нмоль/л Malondialdehyde, nmol/L
Печень Liver	42,73 [37,85–51,06]	87,13 [64,39–98,93]		107,00 [87,62–154,11]
	p=0,000000		p=0,000003
Почки Kidney	63,54 [58,92–69,30]	118,58 [102,88–126,95]		142,74 [127,96–147,73]
	p=0,000183		p=0,001315
Плазма Plasma	40,74 [38,78–42,49]	46,45 [42,54–51,98]		121,50 [106,92–131,45]
	p=0,003611		p=0,000183
Диеновые конъюгаты, у.е. Diene conjugates, au
Печень Liver	0,77 [0,54–0,87]	0,76 [0,70–0,89]		1,25 [1,15–1,40]
	p=0,123445		p=0,000000
Почки Kidney	0,19 [0,18–0,21]	0,77 [0,76–0,82]		0,78 [0,69–0,87]
	p=0,000183		p=0,733730
Плазма Plasma	1,08 [1,02–1,16]	1,15 [1,11–1,18]		1,24 [1,21–1,28]
	p=0,075663		p=0,002827
Триеновые конъюгаты, у.е. Triene conjugates, au
Печень Liver	0,61 [0,44–0,70]	0,57 [0,48–0,69]		0,98 [0,91–1,09]
	p=0,627323		p=0,000000
Почки Kidney	0,06 [0,05–0,07]	0,60 [0,56–0,68]		0,45 [0,39–0,46]
	p=0,000183		p=0,000183
Плазма Plasma	0,86 [0,80–0,93]	0,33 [0,30–0,36]		0,88 [0,74–0,93]
	p=0,000183		p=0,000183
Шиффовы основания, у.е. Schiff bases, au
Печень Liver	0,28 [0,21–0,33]	0,71 [0,61–0,82]		0,61 [0,57–0,69]
	p=0,000000		p=0,001456
Почки Kidney	0,010 [0,009–0,011]	0,320 [0,311–0,324]		0,182 [0,163–0,199]
	p=0,000183		p=0,000183

Среда Sample type	Группа Group
	К56	Cdст		Cd28
Плазма Plasma	0,14 [0,13–0,16]	0,33 [0,31–0,37]		0,59 [0,52–0,62]
	p=0,000183		p=0,000183

Примечание. К56 – контрольная группа на 56-й день, Cdст – группа животных, переведенных на стандартный рацион после поступления кадмия в течение 28 дней, Cd28 – группа интоксикации кадмия ацетатом на 28-й день.

Note. K56 – control (day 56); Cdст –animals switched to a standard diet after 28-day cadmium exposure; Cd28 – cadmium acetate intoxication (day 28).

Количество ДК значимо снижалось в печени, достигая уровня контроля (табл. 2). В плазме уровень ДК также достиг контрольных значений. В то же время в почках содержание ДК практически не изменилось в сравнении с группой Cd28, различия с контролем статистически значимы. Показатель ТК в почках повысился и достиг максимального значения и варьирования за весь период эксперимента (0,60 у.е., IQR почки 0,03–0,12). Возможно, это связано с тем, что ТК являются более устойчивыми продуктами перекисного окисления липидов, вследствие чего они могут накапливаться в тканях [21]. Также повышение концентрации первичных продуктов в почках может продолжаться из-за накопления кадмия почками и его дальнейшего влияния на окислительные процессы в тканях. В печени наблюдается снижение содержания ТК до уровня контроля, в плазме уровень ТК снизился в 2,67 раза в сравнении с группой интоксикации, что можно объяснить вымыванием ТК из тканей, их взаимодействием с белками.

После прекращения поступления кадмия ацетата наблюдалось снижение концентрации МДА в плазме в 2,6 раза по сравнению с группой Cd28 (табл. 2), но различия с интактными животными остаются статистически значимыми. В печени и почках наблюдалась схожая тенденция: снижение в 1,23 и 1,2 раза соответственно без достижения контрольных чисел.

Субхроническая кадмиевая интоксикация оказывает динамическое влияние на белковые структуры клетки даже при прекращении поступления ксенобиотика в организм, о чем

свидетельствует продолжающий расти уровень ШО в тканях (табл. 2). Переход на стандартный рацион не позволил снизить концентрацию побочных белковых продуктов в органах-мишенях, наблюдалось максимальное увеличение показателя в печени (0,71 у.е.) и почках (0,320 у.е.). При этом в плазме концентрация снижалась в 1,8 раза, но различия с контролем оставались значимыми. Увеличение концентрации ШО после перехода на стандартный рацион может свидетельствовать о тенденции к хронизации процессов перекисного окисления липидов и белков. Если в норме ШО образуются с целью утилизации токсических продуктов окисления, то их хроническое накопление приводит к нарушению процессов синтеза ферментов, рецепторной способности клетки, функционирования клеточной мембраны и деления клетки, следствием чего может быть апоптоз [22].

Заключение. В ходе проведенных исследований установлено, что поступление кадмия ацетата в дозе 1/50 LD 50 в течение 28 дней вызывает окислительный стресс в плазме, печени и почках. Кадмий индуцирует продукцию АФК, интенсифицирует процессы липо- и протеиноперок-си-дации. После прекращения поступления кадмия ацетата организм не способен к полному восстановлению прооксидантно-антиоксидантного баланса. Процессы окисления продолжаются в тканях печени и почек как основных органов-мишеней кадмия, наблюдается переход к хроническому повреждению липидов и белков, что свидетельствует о необходимости коррекции антиоксидантного статуса организма.