Влияние клеточной и генной терапии на заживление трофических язв у пациентов с нейроишемической формой синдрома диабетической стопы

По данным руководства международной рабочей группы по диабетической стопе в настоящее время наблюдается широкая распространенность и неуклонный рост числа больных сахарным диабетом (СД): в 2011 году – у 8,3%, а к 2030 году – у 9,9%. населения планеты [5]. СД приводит к развитию целого ряда серьезных осложнений, одно из которых – синдром диабетической стопы (СДС), встречающийся у 25% пациентов с СД [5, 7]. СДС характеризуется возникновением хронических гнойно-некротических процессов (трофических язв) на стопе с поражением кожи, мягких тканей и костно-суставного аппарата, вследствие патологических изменений в периферической нервной системе (диабетическая нейропатия) и в сосудистой системе (диабетическая ангиопатия). При этом у всех больных СДС имеет место микроангиопатия, когда повреждается система микрососудов, а у части больных к тому же отмечается макроангиопатия – преимущественное поражение артерий голени и стопы с постепенным диффузным развитием окклюзии их просвета за счет медиакальциноза, впервые описанного Йоганном Менкебергом в 1903 г. [6, 7]. В клинической практи- ке различают нейропатическую и нейроишемическую формы СДС. Нейроишемическая форма СДС подразумевает наличие у больного не только микроангиопатии, но и макроангиопатии, подтвержденной данными ультразвукового исследования или ангиографии.

Стандартное лечение нейроишемической формы СДС включает в себя медикаментозную терапию и сосудистую реконструкцию – как правило, эндоваскулярные вмешательства на пораженных артериях голени и стопы (баллонирование, стентирование), местное лечение трофической язвы. Однако, эффект эндоваскулярного хирургического вмешательства носит временный характер – в пределах полгода – двух лет, что объясняется диффузным характером поражения артерий и сохраняющейся микроангиопатией [10]. Заживление трофической раны при нейроишемической форме СДС часто представляет сложную задачу, из-за сохраняющихся нарушений микроциркуляции и резкого снижения местных репаративных процессов. Значительное количество пациентов (25%) с СДС, поэтому подвергаются ампутациям конечности, становясь инвалидами, а многие из них (30–40%) погибают [13] Это делает актуальным поиск новых методов лечения при этой патологии. Одним из перспективных направлений для решения этой задачи может быть использование продуктов клеточных и генных технологий, которые появились в арсенале медицины в последнее время. Так, в целом ряде работ показана возможность улучшения перфузии тканей при СДС за счет технологии терапевтического ангиогенеза на основе использования внутри-мышечного/внутриартериального введения (в мышцы голени) различных клеток, чаще всего выделенной из аутологичного костного мозга мононуклеарной фракции (МФАКМ) или культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [11, 14, 24]. МФАКМ предпочтительнее ММСК [17, 19].

Применение геннотерапевтических конструкций безопасно, эффективно и достоверно по данным ангиографии демонстрирует неоангиогенез [4, 22, 23, 25, 24]. В частности, в Российской Федерации (ОАО «Институт стволовых клеток человека», Москва), был создан и в 2011 году зарегистрирован для клинического применения первый в мире лицензированный геннотерапевтический препарат с геном VEGF-А165. Этот препарат эффективен для терапевтического ангиогенеза при лечении неоперабельных форм хронической ишемии нижних конечностей [4, 27]. Для ускорения заживления трофических язв было предложено использование (аппликацию на рану) тканеинженерных конструкций, являющихся эквивалентом дермы (ДЭ) или кожи [1, 16, 18, 20], которые хорошо зарекомендовали себя при лечении трофических язв венозной этиологии [1, 12, 18]. Однако, сведения об эффективности этих методов, при лечении нейроишемической формы СДС еще немногочисленны и противоречивы [15], мало изучена динамика микроциркуляции при этом, что делает актуальным дальнейшее исследования в этом направлении.

Целью исследования является оценка влияния клеточной терапии (МФАКМ и ДЭ) и генной терапии («Неоваскулген») на скорость заживления ран и состояние микроциркуляции в области стопы и нижней трети голени у пациентов с нейроише-мической формой синдрома диабетической стопы.

Материалы и методы

Обследовано 80 пациентов нейроишемической формой СДС, которые были разделены на исследуемые группы в зависимости от характера проводимого лечения и 20 здоровых лиц (контроль) для определения эталонных показателей микроциркуляции. Выделяли 4 исследуемые группы: Группа A (n=20) – стандартное консервативное лечение и местное лечение ран. Группа B (n=24) – стандартное консервативное лечение, местное лечение ран и эндоваскулярная хирургическая реконструкция. Группа C (n=28) – стандартное консервативное лечение, местное лечение ран, внутримышечное введение (в мышцы голени) МФАКМ, наложение дермального эквивалента. Группа D (n=8) – стандартное консервативное лечение, местное лечение ран, внутримышечное введение (в мышцы голени) «Неоваскулген.

Распределение по полу и возрасту в каждой группе было практически идентично. По Техасской классификации степень поражения СДС – DII-DIII, а по Вагнеру 2-4 ст. Всеми пациентами были подписаны информированные согласия при поступлении в стационар. Контрольную группу составили здоровые лица (20 человек, 9 мужчин, 11 женщин), (средний возраст 55±12 лет), которые не имели сердечно-сосудистых заболеваний и СД.

Взятие красного костного мозга (ККМ) (миелоэксфузию) в условиях общей анестезии проводили из единого доступа на задней поверхности обеих крыльев подвздошных костей с использованием трепан – иглы путем многократных проколов кости. Извлечение ККМ проводили в объеме 320±10 мл (+32 мл NaCl 0,9%/гепарин). Повязка антисептиком.

В результате седиментации получали аутоэритроциты в объеме 70±15 мл., которые затем возвращали пациенту в/в. Конечный объем МФАКМ составлял 60±10 мл. Из них СD 34+ cоставляли 0,56±0,4%, а NC 3,5-4,2*109 клеток/мл.

Введение МФАКМ проводили в день забора ККМ. Временной интервал составлял 4-5 часов. Введение производили c помощью множественных (40±10) внутримышечных инъекций (игла 29G) в массив мышц голени начиная от зоны хорошего кровоснабжения, двигаясь в дистальном направлении [19].

Дермальный эквивалент (ДЭ) – комплексный биотехнологический продукт, включающий в себя культивированные in vitro дермальные фибробласты (ФБ) человека, заключенные в гель из коллагена первого типа. Культивирование ФБ и приготовление из них ДЭ осуществлялось в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, в соответствии с модифицированной методикой Bell E. (1979). Пересадка ДЭ в условиях чистой перевязочной, в асептических условиях. Транспортировка клеточных культур производилась в герметичных чашках Петри, в сосуде Дьюара, с поддерживанием температуры 15°C, в максимально щадящем для клеточных культур режиме, исключающем механическое и термическое воздействие. Доставку производили в день наложения ДЭ. Наложение производили в стадию очищения раны, полностью покрывая площадь раны. Накладывали асептическую повязку и следили за отсутствием соприкосновения с ДЭ и повязки, стремились к предотвращению высыхания ДЭ, поддерживали влажную среду в ране [1].

Препарат «Неоваскулген» производится ПАО «Институт Стволовых клеток человека», г. Москва. На базе Гематологического научного центра (ФГБУ ГНЦ) МЗ РФ, г. Москва. Препарат прошел все необходимые доклинические и клинические исследования, и на основании их результатов 28 сентября 2011 г. был включен в государственный реестр лекарственных средств для медицинского применения РФ. Регистрационное удостоверение на препарат получено Компанией 7 декабря 2011 г. (РУ № ЛП-000671). Он включен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП) для медицинского применения на 2016 год в соответствии с распоряжением Правительства РФ от 26 декабря 2015 года № 2724-р. Препарат вошел в список под группировочным наименованием Дезоксирибонуклеиновая кислота плазмидная [сверхскручен-ная кольцевая двуцепочечная]. Неоваскулген разработан в Ин- ституте Стволовых Клеток Человека (ПАО «ИСКЧ», г. Москва) и является первым в мире препаратом с механизмом действия, стимулирующим терапевтический ангиогенез (лечебный рост сосудов). Препарат применяется для лечения ишемии нижних конечностей и представляет собой плазмидную ДНК, несущую человеческий ген VEGF 165, кодирующий синтез фактора роста эндотелия сосудов [4].

Измерение напряжения кислорода (TcPO2) и фотографирование для определения площади язв проводилось до начала лечения (2-3-й день госпитализации), через 2 недели и через 3 месяца после лечения.

Измерение TcPO2 пораженной нижней конечности производилось в области тыльной поверхности стопы и верхней трети голени с равномерным капиллярным ложем без крупных артерий и вен, язвенных дефектов или волосяного покрова при использовании транскутанного двухканального оксимонитора (Radiometer, Дания). Пациент во время исследования находился в положении лежа на спине в спокойном и расслабленном психоэмоциональном состоянии. Температура в помещении, в котором проводили измерение, была 21 – 23˚С. Перед началом измерения проводили калибровку электрода атмосферным воздухом. Электрод устанавливался в фиксирующее кольцо на коже после предварительной обработки антисептическим раствором. Полость фиксирующего кольца предварительно заполнялась раствором электролита (2-3 капли). Затем датчик устанавливался в фиксирующее кольцо на кожу. Регистрация показателей TcPO2 после установки датчика на кожу проводилась после их стабилизации через 10-15 минут и достижении температуры кожи 43˚С. [2].

Площадь повреждения ран и оценку скорости эпителиза-ции определяли с помощью фотографирования ран, в каждом кадре была сантиметровая линейка для стандартизации процесса. Оценка площади повреждения ран и скорости эпители-зации проводилась в стадию очищения. Последующая обработка фотографий проводилась в программном каталоге для анализа изображений (оценка площади трофических язв) MMC Multimeter (MultiMedia Catalog) (ММС Soft, Санкт-Петербург, РФ). Этот метод является нашей разработкой и, в отличие от метода контактной планиметрии (Юпатов, 1975), [9] способствует более детальному исследованию раны, осуществляет фотодокументирование, оценивается скорость эпителизации.

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием определения распределения на «нормальность» (тест Колмогорова-Смирнова). Если данные, не соответствовали нормальному распределению, они логарифмировались. Статистическая достоверность определялась для независимых выборок при помощи непараметрического критерия Краскелла-Уоллиса. Сравнение между тремя точками исследования (до, 2 нед., 3 мес.) для каждой группы проводилось при помощи непараметрического критерия Вилкоксона. Достоверными считались значения М±σ, при p≤0,05.

Результаты

Cкорость эпителизации ран, у пациентов групп С и D (0,2±0,04 и 0,3±0,02 см2/сутки, соответственно) достоверно выше (p<0,05), чем у пациентов группы А и B (0,08±0,02 и 0,1±0,07 см2/сутки, соответственно). Достоверное уменьшение площади раны в группе C наблюдали раньше других групп, уже через 2 недели (12±2,7 см2) после лечения. Наиболее выраженное уменьшение площади ран отмечали через 3 месяца в группах С и D (3,4±1,3 и 2,2±0,6 см2, соответственно). Между группами А и B достоверных различий не обнаружено, однако, наблюдаются достоверные различия между группами А и B в площади заживления ран (23,2±4,8 и 5,1±2,1 см2, соответственно) через 3 месяца после лечения, за счет увеличения зоны краевой эпителизации и увеличения числа грануляционной ткани, что свидетельствует об эффективности эндоваскулярной хирургической реконструкции в отличие от стандартного консервативного лечения (табл. 1).

Для определения эталонных показателей TcPO2 в области тыльной поверхности стопы получили 48,1±2,1 мм рт.ст. в контрольной группе, что соответствует литературным данным [1, 19, 26]. В группе пациентов, получавших только консервативное лечение (группа А) (29,9±4,8 мм рт.ст.) через 3 месяца после лечения нет достоверных различий по сравнению с данными (26,2±4,9 мм рт.ст), полученными до лечения. При сочетании консервативного и оперативного лечения через 3 месяца отмечались достоверные различия (p≤0,05) с группой А (29,9±4,8 мм рт.ст) во всех остальных исследуемых группах: B (38,2±6,9 мм рт.ст.), С (44±0,9 мм рт.ст.), D (47,04±2,1 мм рт.ст.). Показатели TcPO2 в группах С и D достигали уровня контрольных значений через 3 месяца после лечения (табл. 2).

Для определения эталонных показателей TcPO2 в области верхней трети голени получили 58,6±0,7 мм рт.ст. в контрольной группе, что соответствует литературным данным [1,19, 26]. При использовании генной терапии (группа D) (48,4±1,6 мм рт.ст.) через 2 недели после лечения отмечались достоверные различия (p≤0,05) с группой А (37,4±7,4 мм рт.ст.). При сочетании консервативного и оперативного лечения через 3 месяца отмечались достоверные различия (p≤0,05) с группой А (40,4±6,3 мм рт. ст) во всех остальных исследуемых группах: B (50,4±9,2 мм рт.ст.), С (49,4±4,6 мм рт.ст.), D (57,8±3,1 мм рт.ст.). Через 3 месяца после лечения показатели в группах С и D достигали уровня эталонных показаелей (табл. 3).

Обсуждение

Известно, что факторами риска развития микро- и макроангиопатий являются гипергликемия, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия, гипер- и дислипидемия, артериальная гипертензия, повышение свертываемости крови и агрегации тромбоцитов, снижение фибринолиза, нарушение функции эндотелия сосудов [7]. Повреждение эндотелия приводит к дефициту выработки сосудистых факторов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который связываясь с рецепторами (VEGF-R2 и VEGF-R1) клеток эндотелия сосудов, участвующих в неоангиогенезе, обеспечивает миграцию клеток

Таблица 1

Площадь повреждения ран и скорость эпителизации у пациентов с нейроишемической формой синдрома диабетической стопы

Группы	S, см			Скорость эпителизации см2/сутки
	До лечения	После лечения
		Через 2 недели	Через 3 месяца
Группа А	31,2±5,3	27,1±4,9	23,2±4,8	0,08±0,02
Группа B	24,3±4,3	17,6±4,3	5,1±2,1	0,1±0,07
Группа С	22,4±4,6	12±2,7	3,4±1,3	0,2±0,04
Группа D	26,6±1,8	14,7±1,3	2,2±0,6	0,3±0,02
Р (B-А)	0,396	0,141	0,027	0,377
P (C-A)	0,193	0,012	0,0001	0,012
P (D-A)	0,760	0,373	0,001	0,001

Обозначения: S, см – площадь; Р (B-А) – статистическое сравнение группы B c группой А; P (C-A) – статистическое сравнение группы С с группой А; P (D-A) – статистическое сравнение группы D c группой А.

Таблица 2

Транскутанная оксиметрия в области тыльной поверхности стопы при нейроишемической форме синдрома диабетической стопы

Группы	TcPO2, мм рт. ст			Р (PO21 - PO22)	Р (PO21 – PO23)	Р (PO22– PO23)
	До лечения	Через 2 недели после лечения	Через 3 месяца после лечения
Контроль	48,1±2,1
Группа А	26,2±4,9	28,9±4,6	29,9±4,8	0,027	0,005	0,058
Группа B	21,2±3,9	31,4±5,7	38,2±6,9	0,0001	0,0001	0,0001
Группа С	21,9±2,9	30,4±3,8	44±0,9	0,0001	0,0001	0,0001
Группа D	17,6±1,6	35,4±0,99	47,04±2,1	0,008	0,005	0,008
Р (B-А)	0,027	0,066	0,0001
P (C-A)	0,415	0,786	0,008
P (D-A)	0,415	0,786	0,008

Обозначения: TcPO2 – чрезкожное измерение напряжение кислорода; Р (Б-А) – статистическое сравнение группы B c группой А; P (C-A) – статистическое сравнение группы С с группой А; P (D-A) – статистическое сравнение группы D c группой А; Р (PO21 - PO22) – статистическое сравнение напряжения кислорода в ткани, полученным через 2 недели после лечения с данными, зарегистрированными до лечения; Р (PO21 – PO23) – статистическое сравнение данных, зарегистрированными через 3 месяца после лечения с данными, зарегистрированными, до лечения; Р (PO22– PO23) – статистическое сравнение данных, зарегистрированных через 2 недели и через 3 месяца после лечения.

эндотелия в зону повреждения. Быстрое внедрение клеток в зону неоангиогенеза ускоряет восстановление сосудов, позволяет избежать потенциальных сосудистых осложнений: вторичного тромбоза и гипоксии. Восстановление кровоснабжения в ишемизированных тканях нижних конечностей зависит от баланса между образованием кровеносных и лимфатических сосудов. Применение стволовой или генной терапии стимулирует выработку VEGF, который ускоряет восстановление функции ишемизированной нижней конечности посредством увеличения скорости образования лимфатических и кровеносных микрососудов и уменьшением отека [26, 28]. Предполагается, что при клеточной терапии МФАКМ в неоваскуляризации участвуют предшественники эндотелиоцитов (ПЭ) CD34+ фракции стволовых клеток периферической крови взрослых после их мобилизации из красного костного мозга (ККМ) [11, 25].

Критическим показателем TcPO2 считается уровень менее 20 мм рт.ст. (в норме 50-80 мм рт.ст.). Благоприятное заживление ран находится в диапазоне от 20 до 55 мм рт.ст. [8]. Согласно рекомендациям TASC II, у всех пациентов с клиническими признаками и симптомами ишемии конечности регистрируются показатели TcPO2 менее 30 мм рт.ст. [21]. Пациентам, которым применяли генную терапию препаратом «Неоваскулген» после 2-х недель наблюдения, наблюдали улучшение состояния микроциркуляции и уменьшение площади раны. Пациентам, которым применяли сочетание стандартной консервативной терапии, клеточной терапии МФАКМ, генной терапии препаратом «Неоваскулген» через 3 месяца после лечения отмечали улучшение состояния микроциркуляции и практически

Таблица 3

Транскутанная оксиметрия в области верхней трети голени у пациентов с нейроишемической формой синдрома диабетической стопы

Группы	TcPO2, мм.рт.ст			Р (PO21 - PO22)	Р (PO21 – PO23)	Р (PO22– PO23)
	До лечения	Через 2 недели после лечения	Через 3 месяца после лечения
Контроль	58,6±0,7
Группа А	38,3±4,3	37,4±7,4	40,4±6,3	0,074	0,330	0,873
Группа B	37,3±6,8	36,9±6,7	50,4±9,2	0,0001	0,0001	0,0001
Группа С	36,8±3,9	44,3±1,5	49,4±4,6	0,705	0,0001	0,0001
Группа D	25,9±0,3	48,4±1,6	57,8±3,1	0,157	0,157	0,157
Р (B - А)	0,011	0,013	0,0001
P (C - A)	0,839	0,943	0,006
P (D - A)	0,823	0,165	0,07

Обозначения: TcPO2 – чрезкожное измерение напряжение кислорода; Р (B-А) – статистическое сравнение группы B c группой А; P (C-A) – статистическое сравнение группы С с группой А; P (D-A) – статистическое сравнение группы D c группой А; Р (PO21 - PO22) – статистическое сравнение напряжения кислорода в ткани, полученным через 2 недели после лечения с данными, зарегистрированными до лечения; Р (PO21 – PO23) – статистическое сравнение данных, зарегистрированными через 3 месяца после лечения с данными, зарегистрированными, до лечения; Р (PO22– PO23) – статистическое сравнение данных, зарегистрированных через 2 недели и через 3 месяца после лечения.

полное заживление язвенных дефектов. Пациентам, которым применяли только стандартную консервативную терапию, даже после 3-х месяцев наблюдения отмечали терминальные показатели TcPO2 в области тыльной поверхности стопы. В этой области значения TcPO2 определяются в большей степени проходимостью передней большеберцовой артерии (ПББА) и тыльной артерией стопы (ТАС) [2]. В ходе нашего наблюдения генная терапия препаратом «Неоваскулген» оказывает ранний эффект, уже через 2 недели после введения, однако, клеточная терапия МФАКМ позже, через 3 месяца после лечения, показывает достоверные улучшения состояния микроциркуляции и заживление раневых дефектов.

Выводы

• 1.    Клеточная терапия МФАКМ, ДЭ и генная терапия препаратом «Неовасакулген» улучшают показатели микроциркуляции, улучшают состояние эндотелия, стимулируют заживление язвенных дефектов.

• 2.    Генная терапия препаратом «Неоваскулген» показывает более ранний эффект, через 2 недели после введения, в отличие от клеточной терапии МФАКМ и ДЭ, которая отвечает через 3 месяца после введения.