Влияние конформации спирали H38 на стабильность предреакционного состояния пептидилтрансферазного центра рибосомы: молекулярно-динамическое исследование

Одним из средств, используемых бактериями для защиты рибосомы от антибиотиков, является адаптивное метилирование остатков рибосомных РНК, участвующих в связывании антибиотиков и реализации их воздействия на рибосому. Примером может служить метилтрансфераза Erm [1], чей биосинтез регулируется лидерным пептидом ErmBL. Этот фермент вводит две метильные группы на экзоциклическую аминогруппу основания A2058 23S рибосомной РНК, что подавляет связывание макролидов в рибосомном туннеле. Матричная РНК, кодирующая стоп-пептид ErmBL и метилтрансферазу Erm, образует две шпильки: первая включает конец кода ErmBL, вторая – скрывает открытую рамку считывания Erm. Синтез лидерного пептида ErmCL приводит к расплетанию первой шпильки и перестройке вторичной структуры матричной РНК: вторая шпилька также расплетается, а её 5’-концевой участок формирует новую шпильку с 3’-концевым участком первой. При этом освобождается открытая рамка считывания Erm и становится возможен его синтез. В отсутствие антибиотика синтез ErmBL быстро завершается, так что открытая рамка считывания Erm скоро скрывается обратно. В присутствии антибиотика синтез ErmBL останавливается, так что открытая рамка считывания Erm надолго становится доступна другим рибосомам, которые начинают вырабатывать метилтрансферазу, обеспечивающую устойчивость рибосом к антибиотикам.

В присутствии эритромицина биосинтез лидерного пептида ErmBL производит аминокислотную последовательность M1LVFQMRNVDK11, где последний остаток Lys11 так и остается связанным с аминоацил-тРНК, так как именно на нем не происходит реакции транспептидации. Критически важными для останова пептидилтрансферазной реакции (ПТР) в пептиде являются остатки Arg7 и Val9-Lys11, то есть находящиеся в самой верхней части рибосомного туннеля. При этом стэкинг-контакт между Phe4 и основанием U2609 не важен для останова, но важен контакт Arg7-U2586 [2].

Известна структура комплекса рибосомы E. coli , связавшей эритромицин и пептид ErmBL, полученная методом криоэлектронной микроскопии (PDB ID 5JTE), и даже есть работы с расчетом молекулярной динамики, основывающиеся на этой структуре [3], хотя и использующие довольно простую модель воды SPC/E и несколько устаревшее ныне силовое поле parm99. Но до сих пор никто не пытался анализировать удаленные изменения от воздействия связавшихся в рибосомном туннеле антибиотиков и растущих пептидов. Более того, в упомянутой работе эффект антибиотика был сведен к ограничению подвижности пептида, смещению А76 пептидил-тРНК на 1–2 Å и невозможности для остатков U2506 и U2585 занять активированное положение, тогда как сам комплекс тРНК с рибосомой не анализировался. Мы же полагаем, что изменения в пеп-тидилтрансферазном центре (ПТЦ) и в структуре связывания аминоацил-тРНК могут быть более существенными и включать дестабилизацию последней, поскольку из тех же экспериментальных данных известно, что пептид ErmBL стабилизирует предаккомадационное состояние аминоацил-тРНК, в котором ССА-конец не вошел в контакт с А-сайтом [2]. Цель данного исследования состояла в том, чтобы найти аллостерические изменения в рибосоме от воздействия эритромицина с ErmBL в туннеле и построить структурные модели с «выключенным» состоянием ПТЦ, включающие модель удаленных участков, что могло бы приблизить нас к поиску аллостерических эффекторов на ПТЦ.

В этом исследовании мы смоделировали несколько траекторий комплекса рибосомы с Lys-A-тРНК и ErmBL-P-тРНК в присутствии и отстутствие эритромицина. Мы смоделировали по 3 траектории длиной 200 нс для каждого из видов систем с тем, чтобы проанализировать первичные изменения структуры при запуске МД. И этот анализ дал интересные результаты.

Экспериментальная часть

Моделируемая система. Исходная система была построена на основе структуры рибосомы E. coli , несущей эритромицин А и лидерный пептид ErmBL (PDB ID: 5JTE), в которую были добавлены модифицированные гетероциклические основания в соответствии с банком данных [4]. Подготовка системы состояла из процедур, описанных ниже:

• •    Установка недостающих белка L1 и нуклеотидов 884–893 23S рРНК из другой структуры рибосомы E. coli (PDB ID: 4V7D [5]); рибосомных белков L10 и L31 из структуры рибосомы E. coli (PDB ID: 5AFI [6]); 1–10 остатков рибосомного белка bL27 из структуры T. thermophilus (PDB id: 1VY4 [7] (с мутагенезом G6A и L7G по нумерации E. coli ); остатки 16–17 Lys-тРНК^Lys в A-сайте из структуры Lys-тРНК и некоторых недостающих атомов в белковых остатках путем выравнивания полных аминокислотных структур.

• •    Оптимизация структуры вновь введенных фрагментов методом наискорейшего спуска в вакууме при фиксации координат атомов остальной части рибосомы.

• •    Добавление ионов калия K⁺ с улучшенными параметрами для воды TIP4P EW [8] вблизи отрицательно заряженных групп [9] для нейтрализации заряда системы и дальнейшая оптимизация ионов K⁺ в вакууме при фиксации рибосомы и ее лигандов.

• •    Установка рибосомы в ромбическую ячейку размером 27 × 28 × 25 нм, заполненную молекулами воды TIP4P_EW, обеспечивающими слой чистого растворителя толщиной не менее 2 нм с каждой стороны, и добавление ионов K⁺, Mg²⁺ и Cl^- в количестве, соответствующем концентрации KCl в 100 мМ и MgCl 2 в 6 мМ (без учета противоионов K⁺ и Mg²⁺ из исходной структуры).

• •    Оптимизация структуры растворителя и ионов с последующим расчётом молекулярной динамики протяжённостью 5 нс, в ходе которой на все атомы рибосомы, кроме атомов водорода, были наложены позиционные ограничения с константой жесткости 1000 кДж/моль∙нм.

• •    Оптимизация системы короткой молекулярной динамикой с позиционными ограничениями для Cα-атомов для аминокислотных остатков или атомов фосфора рибонуклеотидных остатков вплоть до стабилизации RMSD (обычно 5–10 нс).

Условия моделирования

Молекулярно-динамическое моделирование выполнялось посредством пакета GROMACS 5.1.4 [10, 11] и силового поля AMBER-ff14SB [12]. Пространственные структуры и молекулярные электростатические потенциалы неканонических остатков и эритромицина были получены с помощью квантово-химических расчетов методом Хартри – Фока с базисным набором 6-31G*. Точечные заряды были рассчитаны с использованием модели RESP [13]. Моделирование проводилось при T = 310 K, поддерживаемой термостатом масштабирования скоростей с дополнительным стохастическим членом [14] и периодом релаксации 0,1 пс, и изотропным постоянным давлением, контролируемым баростатом Берендсена [15] с периодом релаксации 5 пс. По всем трём измерениям действовали периодические граничные условия. Радиус обрезания для ван-дер-ваальсовых и кулоновских взаимодействий составлял 1 нм. Электростатические взаимодействия обрабатывались с помощью сети частиц Эвальда [16] с шагом сетки 0,125 нм и интерполяцией четвертого порядка. Шаг интегрирования во всех расчетах составлял 2 фс. Алгоритм LINCS [17] применялся для ограничения длины ковалентных связей атомов водорода. Остальные условия МД-моделирования были идентичны описанным в работе [20].

Методы анализа траекторий. Встречаемость водородных связей и стэкинг-взаимодействий оценивали на конечных участках траекторий с установившейся величиной RMSD в соответствии с определенными геометрическими критериями. Для водородных связей это:

• •    расстояние между донором и акцептором водорода не более 3,5 Å,

• •    угол акцептор – донор – водород не более 30°.

Что касается стэкинг-взаимодействия, то среднее арифметическое координат трёх определенных атомов в ароматической плоскости (C2, C4 и C6 для пиримидиновых оснований и N1, N3 и C8 для пуриновых, аналогично для ароматических аминокислот) принималось за центр азотистого основания, а плоскость, содержащая эти три точки, считалась «плоскостью основания», поэтому требования для распознавания стэкинг-взаимодействия в определенном кадре траектории были следующими:

• •    расстояние между центрами не более 5,5 Å,

• •    угол между плоскостями не более 30°,

• •    угол между плоскостью первого основания и отрезком между центрами более 45°; в противном случае копланарные основания, противостоящие друг другу как пара оснований, могут быть ошибочно определены как стэкинг.

Средние встречаемости взаимодействий и стандартные отклонения рассчитывали по трём соответствующим значениям для траекторий систем, содержащих эритромицин. Консервативность остатков РНК оценивали по базе данных SILVA [1].

Обсуждение результатов

Анализ молекулярно-динамических траекторий показал значительную подвижность пептида в туннеле и вариабельность его контактов даже в присутствии антибиотика. Особенно ярко эта вариабельность проявляется для первых 6 остатков аминокислот, для которых не обнаруживалось почти никаких воспроизводящихся связей в присутствии ли эритромицина или в его отсутствии. Так, в большинстве траекторий разрушается стэкинг-взаимодействие Phe4 ErmBL с U2609 23S рРНК, что согласуется с биохимическими данными о том, что мутации по этим остаткам не влияют на эффективность останова трансляции. Остаток Arg7 заякоривается своей боковой группой за фосфаты остатков 23S рРНК в верхней части туннеля, в первую очередь это фосфатные группы U2441, C2063, A2439. Также он образует водородные связи с одним из экзоцик-лических кислородов остатка U2586 23S рРНК, которые есть лишь в одной из трех траекторий без эритромицина. Взаимодействие этих остатков важно для останова ПТР. Остаток Asn7 своей остовной аминогруппой образует водородные связи с А2062 (в присутствии эритромицина – чаще). Боковая группа не образует стабильных и воспроизводящихся связей, что коррелирует с данными о том, что этот остаток можно заменить на аланин без снижения эффекта останова ПТР. Амидная группа Val9 формирует остовную связь с остовным кислородом Arg7 только в присутствии эритромицина. Вероятно, эта связь вносит свой вклад в стабилизацию конформации верхней части пептида.

Сам эритромицин в ходе моделирования траектории молекулярной динамики под действием пептида несколько смещается, образуя контакты с G2502 и С2610 преимущественно кладинозой. При этом сохраняется довольно слабая водородная связь между экзоциклической аминогруппой А2058 и дезозамином вследствие его небольшого смещения под действием пептида относительно положения в структуре. Основные взаимодействия пептида и эритромицина в туннеле представлены в табл. 1. Но главный эффект от связывания пептида в туннеле проявлялся на удаленных от него функциональных сайтах.

В отсутствие эритромицина стабилизация структуры ПТЦ и тРНК в рибосоме происходила достаточно быстро, в течение первых 40–60 нс, хотя пептид был более подвижен, иногда занимая то пространство, где ранее находился эритромицин, что можно отследить по графикам RMSD как целой рибосомы, так и области туннеля и связывания тРНК. В этих траекториях атомы потенциальной новой пептидной связи, а именно азот аминогруппы лизина на Lys-А-тРНК и карбоксильный атом углерода аспарагиновой кислоты на ErmBL-тРНК, именуемые в дальнейшем атакующим и атакуемым атомами соответственно, оставались сближенными на 3–4,5 Å (рис. 1, А). При этом первую траекторию можно считать «лучшей» по этому показателю: в ней означенное расстояние в среднем составляло 3,4 ± 0,2 Å. Аминогруппа при этом находилась примерно перпендикулярно плоскости сложноэфирной группы, что удобно для нуклеофильной атаки (рис. 2, А). Это положение обеспечивалось связями Р- и А-тРНК в районе ПТЦ, в том числе образованием стопки последовательных стэкинг-контактов ССА-конца А-тРНК с А-спиралью (Н92): основаниями U2555, C2556, G2557 и далее.

Таблица 1

Вcтречаемость нековалентных взаимодействий пептида ErmBL и эритромицина с рибосомой в различных состояниях

Донор	Акцептор	no Ery	Ery I	Ery Ia	Ery Ib	Ery III
	Водородные связи
A2058/N6–H	Ery/DES/O 2’	0 ± 0	7	18	15	25
A2059/N6–H	Ery/DES/O 2’	0 ± 0	0	2	14	0
Ery/CLD/O 4 –H	U2506/O4	0 ± 0	16	74	92	0
A2062/N6–H	ErmBL/Phe4/O	25 ± 43	0	38	0	94
A2062/O 2′ –H	ErmBL/Asn8/O	23 ± 40	21	79	1	25
A77/O 2′ –H	ErmBL/Asp10/Oγ	7 ± 13	25	1	19	0
A77/O 2′ –H	ErmBL/Asp10/Oγ′	24 ± 42	50	2	16	86
ErmBL/Arg7/N δ –H	C2442/O phosph1	0 ± 0	0	7	31	0
ErmBL/Arg7/N ω –H	A2062/O 3′	13 ± 22	26	59	0	0
ErmBL/Arg7/N ω –H	A2062/O 4′	0 ± 0	15	1	13	0
ErmBL/Arg7/N ω –H	A2439/O phosph2	37 ± 34	0	0	0	39
ErmBL/Arg7/N ω –H	C2063/O phosph1	44 ± 42	0	8	86	74
ErmBL/Arg7/N ω –H	C2442/O phosph2	0 ± 0	11	21	68	0
ErmBL/Arg7/N ω′ –H	A2439/O phosph2	34 ± 56	0	0	0	28
ErmBL/Arg7/N ω′ –H	U2441/O phosph2	83 ± 17	64	99	95	97
ErmBL/Arg7/N ω′ –H	U2586/O 2′	2 ± 3	14	0	0	0
ErmBL/Arg7/N–H	U2586/O2	28 ± 49	33	0	0	69
ErmBL/Arg7/N–H	U2586/O4	0 ± 0	0	31	86	0
ErmBL/Asn8/N–H	A2062/N3	13 ± 18	89	20	64	0
ErmBL/Asn8/N–H	A2062/O2′	20 ± 35	2	21	26	58
ErmBL/Lys11/N–H	ErmBL/Asp10/Oγ	20 ± 35	24	60	0	30
ErmBL/Lys11/N–H	ErmBL/Asp10/Oγ′	6 ± 10	62	10	0	9
ErmBL/Lys11/N £ -H	C2452/N3	16 ± 27	1	29	1	4
ErmBL/Val9/N–H	ErmBL/Arg7/O	0 ± 0	27	4	47	0
G2061/N2–H	ErmBL/Asp10/Oγ	31 ± 8	57	0	0	5
G2061/N2–H	ErmBL/Asp10/Oγ′	36 ± 28	13	58	9	0
U1781/N3–H	ErmBL/Leu2/O	0 ± 0	51	0	0	0
U2585/N3–H	ErmBL/Lys11/O	42 ± 41	0	0	0	0
U2586/N3–H	ErmBL/Gln5/O	0 ± 0	88	80	98	0
A77/O 2′ –H	ErmBL/Asp10/O	0 ± 0	0	0	46	0

Окончание табл. 1

Донор	Акцептор	no Ery	Ery I	Ery Ia	Ery Ib	Ery III
ErmBL/Lys11/N–H	C2507/O phosph1	0 ± 0	0	3	82	0
A2058/N6–H	Ery/DES/O 2’	0 ± 0	7	18	15	25
A2059/N6–H	Ery/DES/O 2’	0 ± 0	0	2	14	0
Ery/CLD/O 4 –H	U2506/O4	0 ± 0	16	74	92	0
G2505/N1–H	Ery/CLD/O 3	0 ± 0	0	0	0	84
L22/Lys90/N £ -H	Ery/LCE/O 12	0 ± 0	0	0	0	86
A2062/N6–H	ErmBL/Phe4/O	25 ± 43	0	38	0	94
A2062/O 2′ –H	ErmBL/Asn8/O	23 ± 40	21	79	1	25

Примечание. No Ery – статистика по трем стабильным участкам траекторий без эритромицина (среднее ± стандартное отклонение), Ery I – состояние первой траектории с эритромицином после 80 нс, Ery IIa – состояние второй траектории с эритромицином между 40 нс и 140 нс, Ery IIb – состояние второй траектории с эритромицином после 160 нс, Ery III – состояние третьей траектории с эритромицином после 220 нс.

Рис. 1. Графики расстояний между атомами потенциальной пептидной связи между Asp10 и Lys11 в стоп-пептиде ErmBL, образование которой не происходит при наличии эритромицина в туннеле: A. Расстояние С–N для траекторий без эритромицина. Синим цветом показана первая, багровым – вторая, зеленым – третья траектории. B. Расстояние С–N в первой траектории с эритромицином. С. Расстояние С–N во второй траектории с эритромицином.

D. Расстояние С–N в третьей траектории с эритромицином

Встречаемость взаимодействий в А-спирали представлена в табл. 2.

Таблица 2

Вcтречаемость нековалентных взаимодействий в рибосомном туннеле и ближайшей окрестности в различных траекториях

Донор	Акцептор	no Ery	Ery I	Ery Ia	Ery Ib	Ery III
Водородные связи
C2611/N4–H	G2505/O6	0 ± 0	54	12	44	0
A2450/N6–H	C2063/N3	3 ± 3	93	43	24	16
G2446/N2–H	C2065/O2	8 ± 8	36	30	81	92
G830/N1–H	m2G2445/O 2′	41 ± 12	2	0	0	3
L4/Gly64/N–H	A2060/O phosph 1	0 ± 0	81	71	75	64
L4/Lys63/N £ -H	G2061/O phosph 1	0 ± 0	46	36	50	0
L4/Lys63/N £ -H	G2061/O phosph 2	0 ± 0	31	29	44	38
L4/Thr65/N–H	A2060/O phosph 1	2 ± 2	65	44	35	26
Стэкинг-взаимодействия
A–tRNA/C74	U2555	98 ± 1	8	85	47	98
U1944	U1955	70 ± 14	0	86	16	0
G2557	C2556	92 ± 1	94	94	96	0
C2559	A2560	54 ± 7	0	10	2	0
A2614	A2577	37 ± 4	12	0	0	0
A945	A2448	43 ± 13	0	0	0	0
C2063	G2061	26 ± 20	100	96	90	100

Примечание. No Ery – статистика по трем стабильным участкам траекторий без эритромицина (среднее ± стандартное отклонение), Ery I – состояние первой траектории с эритромицином после 80 нс, Ery IIa – состояние второй траектории с эритромицином между 40 нс и 140 нс, Ery IIb – состояние второй траектории с эритромицином после 160 нс, Ery III – состояние третьей траектории с эритромицином после 220 нс.

В случае же присутствия эритромицина в туннеле конформационные перестройки, происходившие в нем, приводили к серьезному разобщению атакующей и атакуемой группы. В разных траекториях это происходило за различное, но обозримое время моделирования: в первой траектории это происходило на 60–70 нс, во второй траектории – в первых же наносекундах, в третьей – после 220 нс моделирования, что можно отследить по графикам расстояний между атакующим и атакуемым атомам (см. рис. 1B–D). Во второй траектории разобщение атакующего атома азота и атакуемого атома углерода достигало еще больших величин после 140 нс.

Назовем участок резкого изменения расстояний между атакующим и атакуемым атомами в ПТЦ «переходом», которых наблюдалось всего четыре. Назовем эти переходы и состояния, формирующиеся после них, как I, IIa, IIb и III согласно номерам траекторий, где во второй наблюдалось два перехода. Каждый такой переход сопровождался существенным искажением связывания А–тРНК, в первую очередь, c так называемой А-спиралью (Н92). При каждом переходе так или иначе нарушались взаимодействия тРНК с этими спиралями. Так, в переходах I и IIa происходил полный выход ССА-конца тРНК из стэкинг-взаимодействия с А-спиралью, в результате чего последняя замещала CCА-конец тРНК основаниями G2553 и U2554, образуя стэкинг– взаимодействия уже с ними (рис. 2В). В переходах IIb и III стэкинг ССА-конца тРНК с А-спиралью хотя и сохранялся, но структура комплекса серьезно искажалась из-за разрыва стэкинг-контакта оснований C2556 и G2557, то есть надлома самой А-спирали чуть выше взаимодействия с ССА-концом тРНК (рис. 2D). Во всех этих случаях это приводило к разобщению субстратов ПТР, исключающему образование новой пептидной связи даже спонтанно.

При этом основной «ловушкой» для атакующей аминогруппы лизина в присутствии эритромицина являлась боковая карбоксильная группа Asp10, с которой атакующая аминогруппа образовывала водородную связь, чем стабилизировалось «арестованное» состояние ПТЦ. Впрочем, во второй траектории в состоянии IIb формировалась водородная связь уже между боковыми группами Lys11 и Asp10, что еще больше расталкивало реакционные центры, полностью отворачивая атакующую аминогруппу от ПТЦ. Таким образом, сами субстраты являются «проблемными» для ПТР, поскольку при малейшем нарушении структуры связывания склонны фиксировать себя в нереакционноспособном положении, что и объясняет специфичность останова трансляции на этих остатках. Хотя этот фактор является лишь вспомогательным, так как при замене Asp10 на некоторые другие остатки без карбоксильной группы останов также происходил, хотя и в меньшей степени [21]. Так что ключевую роль в останове играют именно искажения структуры реакционного комплекса в ПТЦ.

Рис. 2. Структура комплекса рибосомы с Lys-А-тРНК и ErmBL-Р-тРНК в отсутствие и присутствии эритромицина в туннеле. Малиновым цветом показаны ССА-концы тРНК, розовым – пептид ErmBL, ярко-салатовым выделена т. н. А-спираль (Н92), с вершиной которой ССА-конец А-тРНК образует стопку согласно структурным данным.

Черным пунктиром соединены атомы потенциальной новой пептидной связи. A. Центроид основного кластера окружения пептида ErmBL в объединенных траекториях без эритромицина. B. Центроид основного кластера окружения пептида ErmBL в первой траектории с эритромицином. С. Центроид основного кластера окружения пептида ErmBL во второй траектории с эритромицином. D. Центроид основного кластера окружения пептида ErmBL в третьей траектории с эритромицином

В частности, эритромицин «давит» на стопку A2058||A2059||m2A2503||G2061||C2063 и фиксирует ее в положении максимального взаимодействия с Н74 непосредственно рядом с ПТЦ. Это воздействие заметно смещает саму спираль Н74.

Но это не единственное различие в структуре связывания А-тРНК с рибосомой. При всех переходах изменялись взаимодействия локтя А-тРНК с A896 Н38 23S рРНК, именуемой также A-site finger: если в отсутствие эритромицина остаток А896 образовывал стэкинг-контакт преимущественно с G19 А-тРНК (рис. 3A) на самой вершине локтя, то при наличии эритромицина в системе контакт смещался к его уотсон-криковскому партнеру С56 А-тРНК, что означает заметное вращение самой А-тРНК (рис. 3B).

Рис. 3. Структура контакта между вершиной H38 (ASF) и Н84 в траекториях, содержащих ErmBL.

A. Центроид основного кластера окружения контакта Н38/Н84 в первой (лучшей по расстоянию С–N) траектории без эритромицина. B. Центроид основного кластера окружения контакта Н38/Н84 в объединенных траекториях с эритромицином

Изменение взаимодействий локтя А-тРНК с вершиной Н38 (или ASF, A-site finger) происходит на фоне изменений структуры этой вершины, ее как внутренних, так и внешних взаимодействий прежде всего со спиралью Н84. Эти две спирали образуют любопытный контакт, который функционально важен: если вершина Н38 связывает локоть А-тРНК, то Н84 через тонкую прослойку фрагмента белка L5 контактирует с локтем Р-тРНК. При локте Р-тРНК вершина Н84 формирует стопку оснований, куда встраивается Phe77 белка L5: A2309||C2310||Phe77||A2311|| G2307||C2306||U2305, при этом основание G2308 может выпетливаться и контактировать с вы-петливающимся из ASF U890. В исходной структуре и в некоторых участках траектории с эритромицином (например, в состоянии I, IIa) эти выпетливающие остатки сближались так, что могли образовать водородную связь (см. рис. 3В). В других структурах с эритромицином этот контакт и вовсе полностью расходился. В структуре же без эритромицина, которую можно считать «лучшей», с наиболее хорошо сближенными субстратами ПТР, эти выпетливающиеся остатки образовывали прочное стэкинг-взаимодействие (см. рис. 3А). Но в целом, спирали были более сближены в траекториях без эритромицина, чем с ним. Более того, в присутствии эритромицина так или иначе нарушалась стопка вершины Н84 при локте Р-тРНК (см. рис. 3В).

Таким образом, можно заключить, что присутствие эритромицина в туннеле приводит к нарушению контактов вершин Н38 и Н84 и, как следствие, нарушению взаимного позиционирования А- и Р-тРНК. Что касается аллостерического взаимодействия ПТЦ и ASF, то оно возможно, так как большой рычаг спирали Н38 основанием уходит в область, близкую к ПТЦ со стороны спирали Н74, которая смещается под воздействием эритромицина.

Также стоит упомянуть, что структура вершины Н38 плохо различима в структурах рибосомы, полученных методом рентгеноструктурного анализа, и крайне разупорядочена в структурах, полученных методом криоэлектронной микроскопии, и эта ситуация не меняется даже при большом разрешении метода [18]. Причем известно, что функциональное значение этой спирали заключается не только в поддержании связывания А-тРНК: анализ данных мутагенеза и химического зондирования дает основания полагать, что эта спираль участвует в передаче аллостерического сигнала между различными функциональными центрами, включая ПТЦ и центр связывания элонгационных факторов [19]. Нечеткость структурных данных говорит о том, что у структуры Н38 и ее контактов с Н84 есть не одно конформационное состояние, которое зависит от состояния рибосомы в целом. В большинстве структур эти спирали не взаимодействуют, но при запуске молекулярной динамики контакты между ними образуются даже там, где их не было: в частности, при получении структуры А/А, Р/Р-состояния рибосомы из предаккомадационного состояния (PDB ID: 5AFI) контакты между U890 H38 и G2308, G2309 H84 формировались по мере постадийной оптимизации структуры со вписанной в нее А-тРНК, несмотря на то, что U890 в исходной структуре находилась во внутриспиральных стэкинг-взаимодействиях.

Очевидно, что данное взаимодействие между H38 и H84 имеет особое влияние на взаимное расположение тРНК, в том числе в ПТЦ. Изменение этих взаимодействий меняет даже основание А-тРНК, с которым взаимодействует ASF. С другой стороны, структурные данные по контактам этих спиралей вызывают вопросы. Следовательно, для получения более четких картин комплексов рибосомы с различным состоянием ПТЦ (как активным, так и «выключенным») понадобится уточнение возможных структур этого участка 23S рРНК.

Заключение

Смоделирован комплекс рибосомы в каноническом А/А, Р/Р состоянии, содержащий стоп-пептид ErmBL как в присутствии антибиотика эритромицина, так и без него. Связывание эритромицина в рибосомном туннеле провоцирует значительное расхождение субстратов пептидил-трансферазной реакции, и таким образом, ингибирует ее. Разупорядочивание субстратов ПТР друг относительно друга связано с изменением паттерна связывания А-тРНК рибосомой, что проявляется как в А-сайте недалеко от ПТЦ, так и в области локтя А-тРНК, образующего стэ-кинг-контакт со спиралью Н38 23S рРНК. Вершина этой спирали не разрешена в исходной структуре, как и во многих других структурах рибосомы, однако ее конформация и контакты как с А-тРНК, так и со спиралью Н84 имеют значимое влияние на расположение А-тРНК в целом, и, как следствие, стабилизацию или разрушение предреакционного состояния пептидилтрансфераз-ного центра. Это необходимо иметь в виду при моделировании структур рибосом, где важно понять состояние ПТЦ, для чего необходимо производить дополнительную оптимизацию спирали Н38 перед запуском основного расчета молекулярной динамики.