Влияние курения на образование антител к химическим канцерогенам и стероидным гормонам у здоровых мужчин и больных раком легкого

Общеизвестна роль курения в возникновении злокачественных опухолей у человека. Ранее предположили, что при канцерогенезе имеют место нарушения иммунохимического гомеостаза [1], проявляющиеся, в частности, в дисбалансе образования: антител (АТ) разных классов к химическим канцерогенам окружающей среды; АТ к низкомолекулярным ксено- и эндобиотикам (стероидным гормонам). У больных раком, в том числе раком легкого (РЛ), были выявлены АТ к химическим канцерогенам [2-4]. Однако до сих пор не исследованы особенности образования АТ к стероидным гормонам при онкологических заболеваниях. Между тем, в легочной ткани и в клетках РЛ обнаружены рецепторы эстрогенов, прогестерона, андрогенов [5, 6]. Предполагается, что эстрогены стимулируют, а прогестерон ингибирует пролиферацию клеток РЛ [7, 8]. В таком случае, АТ к стероидным гормонам способны модулировать их функцию и влиять на процессы канцерогенеза наряду с АТ к химическим канце-рогенам.

Цель работы : выявить особенности образования АТ к бензо[a]пирену (БП), эстрадиолу (ЭС) и прогестерону (ПГ) у курящих мужчин больных РЛ.

Материалы и методы. В обследовании приняли участие 286 мужчин, из них 115 курящих мужчин с диагнозом немелкоклеточный РЛ,

Поленок Елена Геннадьевна, кандидат фармацевтических наук, заведующая лабораторией иммунохимии

Вержбицкая Наталья Евгеньевна, кандидат медицинских наук, заведующая патолого-морфологическим отделом Титов Виктор Александрович, заведующий торакальным отделением

Вафин Илгиз Ахметович, главный врач

Рагожина Светлана Егоровна, заместитель главного врача по медицинской части которые поступили на лечение в Областной клинический онкологический диспансер г. Кемерово. Диагноз РЛ в каждом случае был подтвержден морфологически, рентгенологически и эндоскопически. У основной части больных (74%) был диагностирован плоскоклеточный рак, 13% и 10% составили аденокарцинома и крупноклеточный рак и 3% - другие формы РЛ. В группу сравнения вошли условно здоровые мужчины (171 человек) с Кемеровского центра крови, не болеющие РЛ и другими заболеваниями дыхательных путей. Среди них было 76 (44%) курящих и 95 (56%) некурящих. Все обследуемые мужчины были старше 40 лет.

Забор периферической крови осуществлялся согласно этическим стандартам в соответствии с Хельсинской декларацией 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Мин-здрава РФ № 266 от 19.06.2003 г. Все лица, участвовавшие в исследовании, дали информированное письменное согласие на участие в нем. Исследование АТ к БП, ЭС и ПГ проводили с помощью модифицированного нами неконкурентного иммуноферментного аннализа [3]. Конъюгаты БП-бычий сывороточный альбумин (БП-БСА) были синтезированы по оригинальной методике [9]. Конъюгат ЭС-БСА был синтезирован присоединением БСА к эстрадиол-хинонам, полученным окислением ЭС солью Фре-ми. Коньюгат ПГ-БСА был получен путем конъюгации гемиглутарата 21-гидро-ксипрогестерона и БСА карбодиимидным способом. Уровни АТ к гаптенам выражали в относительных единицах и вычисляли по формуле:

АТ-Х=(ОПх-бса-ОПбса)/ОВбса

где Х= БП, ЭС, ПГ; ОЭ _хбса - связывание АТ с конъюгатом гаптен-БСА, ОВ БСА - связывание с БСА.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием ППП STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., USA). Ненормальный характер распределения показателей определили с помощью критерия Шапиро-Уилка и в дальнейшем статистически значимые различия между группами выявляли с помощью непараметрического критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность вариации и U-критерия Манна-Уитни при уровне значимости p<0,05. Риск возникновения РЛ оценивали с помощью величины ОR с доверительным интервалом (CI) при 95% уровне значимости. Для оценки пороговых значений уровней АТ был проведен ROC-анализ [10] и рассчитаны величины AUC, характеризующие прогностическую значимость показателей.

Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены значения уровней АТ к исследованным соединениям у здоровых мужчин (некурящих и курящих) и у курящих больных РЛ. Выяснилось, что у здоровых курящих мужчин по сравнению с некурящими уровни всех исследуемых АТ, за исключением IgA-БП, не имеют статистически значимых отличий. Уровни IgA-БП значимо выше у курящих. Статистически значимые различия обнаружены между курящими здоровыми и больными РЛ. У последних уровни IgA-БП, IgA-ЭС, IgG-БП выше, а уровни IgG-ПГ ниже в 1,3-1,5 раза. Полученный результат свидетельствует о том, что образование АТ к низкомолекулярным ксено- и эндо-биотикам зависит не столько от канцерогенной нагрузки (небольшие отличия между здоровыми курящи-ми и некурящими), сколько от внутренних инди-видуальных факторов организма (значительные различия между курящими больными и здоровыми).

Таблица 1. Уровни антител классов А и G(IgA, IgG) к бензо[a]пирену (БП), эстрадиолу (ЭС) и прогестерону (ПГ) в сравниваемых группах

	Группа сравнения		Больные РЛ	Р M-W
	некурящие (N=95) Me±m	курящие (N=76) Me±m	курящие (N=115) Me±m
				1-2	2-3
IgA-БП	1,8±0,2	2,5±0,3	3,7±0,6	0,024	0,000001
IgA-ЭС	1,7±0,2	2,0±0,3	2,8±0,4	0,173	0,002
IgA-ПГ	1,9±0,3	1,9±0,5	2,2±0,3	0,172	0,952
IgG-БП	3,3±0,6	4,5±0,9	6,0±0,9	0,170	0,015
IgG-ЭС	4,7±0,4	4,8±0,6	6,1±0,7	0,277	0,136
IgG-ПГ	3,7±0,5	4,4±0,8	3,0±0,6	0,104	0,007

Внутренними факторами, по мнению многих исследователей, являются особенности метаболизма химических канцерогенов и стероидных гормонов, а именно активность ферментов биотрансформации, которая зависит от полиморфизма кодирующих их генов и определяет количество аддуктов низкомолекулярных метаболитов с макромолекулами [11-13]. Далее с помощью регресс-сионного анализа мы исследовали взаимосвязи уровней АТ разных классов (IgA, IgG) к БП, ЭС и ПГ, а также АТ одного класса (IgA или IgG) к БП и ЭС, к БП и ПГ, ЭС к ПГ. Результаты регрессионного анализа возможных взаимосвязей приведены в табл. 2. В уравнении линейной регрессии общего вида y=a * x+b коэффициент корреляции «а» показывает, во сколько раз изменяется уровень IgA-БП (y) при изменении уровня IgG-БП (х) на одну единицу. Видно, что у больных РЛ взаимосвязи между уровнями IgG- и IgA-БП, ЭС, ПГ более выражены (коэффициенты «а» превышают соответствующие значения в обеих подгруппах сравнения). У больных РЛ коэффициент «а» в 2,24,8 раз выше, чем у здоровых некурящих и курящих мужчин соответственно. Это означает, что при одинаковых уровнях IgG-БП, ЭС и ПГ уровни соответствующих IgA-АТ у курящих больных РЛ выше, чем у здоровых мужчин, некурящих и курящих.

При анализе взаимосвязей АТ одного класса, но к разным соединениям, выяснилось следующее.

Искомые взаимосвязи обнаруживаются во всех исследуемых группах. Во всех случаях они прямые, линейные, средней силы (r=0,66-0,74) или сильные (r=0,8-0,92). Для больных РЛ характерно увеличение уровней IgA и IgG-ЭС при одних и тех же уровнях IgA и IgG-БП по сравнению со здоровыми, курящими и некурящими. И наоборот, при одних и тех же уровнях IgA и IgG-БП, у больных РЛ уровни IgA и IgG-ПГ ниже, чем у здоровых. Еще более выражены различия между сравниваемыми группами по характеру взаимосвязей АТ к ЭС и ПГ. При одних и тех же уровнях IgA и IgG-ПГ у больных РЛ уровни IgA и IgG-ЭС значительно выше, чем у здоровых.

Обнаружение описанных выше взаимосвязей послужило основанием для расчета соотношений уровней АТ разных классов к одному гаптену, а также соотношений уровней АТ одного класса к разным гаптенам. После этого с помощью ROC-анализа мы определили критические точки – границы между курящими здоровыми мужчинами и больными РЛ и по частоте встречаемости высоких (>) и низких (≤) значений этих соотношений рассчитали риски (OR) возникновения РЛ у курящих мужчин. В табл. 3 приведены полученные результаты. Величина AUC демонстрирует прогностическую значимость анализа (совокупная оценка чувствительности и специфичности метода) при рассчитанных границах указанных соотношений. Выяснилось, что наибольшие различия между курящими мужчинами, здоровыми и больными РЛ, имеют место при высоких значениях соотношений IgA-БП/ПГ (>1,5) и IgG-БП/ПГ (>2). Величины AUC при этих значениях составляют 0,88 и 0,95, а риск РЛ (OR) возрастает до 6,1 и 11,4. При низких значениях указанных соотношений (≤1,5 и ≤2) OR снижается до 0,2-0,1. Достаточно информативен показатель IgG-ЭС/ПГ >1,5 (OR=11,5 при AUC=0,85).

Таблица 2. Особенности взаимосвязей между антителами классов A и G (IgA, IgG) к бензо[a]пирену (БП), эстрадиолу (ЭС) и прогестерону (ПГ) у здоровых мужчин и больных раком легкого (РЛ)

y	x	Группа сравнения				Больные РЛ
		некурящие (N=95)		курящие (N=76)		курящие (N=115)
		r s (p)	y=a * x+b	r s (p)	y=a * x+b	r s (p)	y=a * x+b
IgA-БП	IgG-БП	0,32 (0,0002)	y=0,11x+1,7	0,18 (0,11)	y=0,05x+2,3	0,61 (0,00001)	y=0,24x+2,9
IgA-ЭС	IgG-ЭС	0,36 (0,0004)	y=0,13x+1,4	0,32 (0,004)	y=0,08x+1,8	0,55 (0,00001)	y=0,21x+1,9
IgA-ПГ	IgG-ПГ	0,22 (0,03)	y=0,06x+1,2	0,16 (0,17)	y=0,05x+2,4	0,51 (0,00001)	y=0,14x+2,1
IgA-ЭС	IgA-БП	0,67 (0,00001)	y=0,4x+1,1	0,66 (0,00001)	y=0,55x+0,8	0,7 (0,00001)	y=0,67x+0,2
IgA-ПГ	IgA-БП	0,65 (0,00001)	y=0,45x+1,5	0,58 (0,00001)	y=0,66x+0,9	0,58 (0,00001)	y=0,31x+1,1
IgA-ЭС	IgA-ПГ	0,79 (0,00001)	y=0,39x+1,1	0,68 (0,00001)	y=0,43x+1,1	0,81 (0,00001)	y=1,33x-0,1
IgG-ЭС	IgG-БП	0,74 (0,00001)	y=0,47x+2,8	0,67 (0,00001)	y=0,43x+3,3	0,66 (0,00001)	y=0,54x+2,9
IgG-ПГ	IgG-БП	0,80 (0,00001)	y=0,63x+1,5	0,66 (0,00001)	y=0,64x+2,0	0,66 (0,00001)	y=0,47x+0,7
IgG-ЭС	IgG-ПГ	0,86 (0,00001)	y=0,66x+2,1	0,81 (0,00001)	y=0,61x+2,3	0,92 (0,00001)	y=1,08x+2,5

Примечание: r s – коэффициент корреляции по Спирмену

Таблица 3. Частота встречаемости высоких (>) и низких (≤) величин соотношений исследуемых АТ у курящих мужчин, здоровых и больных раком легкого (РЛ)

Соотношения АТ	Группа сравнения (N=76) n / %	Больные РЛ (N=115) n / %	Χ2, р	OR (95% CI)	AUC
1. IgA-БП/ЭС >1,5 ≤ 1,5	21/28 55/72	63/55 52/45	12,6 0,001	3,2 (1,6-6,2) 0,3 (0,2-0,6)	0,70
2. IgA-БП/ПГ >1,5 ≤ 1,5	19/25 57/75	77/67 38/33	30,6 0,0005	6,1 (3,0-12,3) 0,2 (0,1-0,3)	0,88
3. IgA ЭС/ПГ >1,1 ≤ 1,1	25/33 51/67	75/65 40/35	17,9 0,0005	3,8 (1,9-7,4) 0,3 (0,1-0,5)	0,72
4. IgG-БП/ЭС >1,5 ≤ 1,5	16/21 60/79	41/36 74/64	3,9 0,045	2,1 (1,01-4,3) 0,5 (0,2-0,9)	0,73
5. IgG-БП/ПГ > 2 ≤ 2	8/11 68/89	66/57 49/43	40,4 0,0005	11,4 (4,8-28,5) 0,1 (0,04-0,2)	0,95
6. IgG ЭС/ПГ >1,5 ≤ 1,5	14/18 62/82	83/72 32/28	50,8 0,0005	11,5 (5,4-24,9) 0,1 (0,04-0,2)	0,85

Выводы: полученные результаты свидетельствуют о том, что особенности образования АТ к химическим канцерогенам и к стероидным гормонам обусловлены не только внешним воздействием (в данном случае курение), но и эндогенными факторами организма. К последним можно отнести:

• -    количество аддуктов указанных низкомолекулярных соединений с макромолекулами организма, т.к. именно они являются индукторами гаптен-специфической иммунной реакции;

• -    HLA-гаплотип, т.к. именно система HLA играет ключевую роль в иммунном распо-знавании

чужеродных агентов (в данном случае гаптенов);

• -    IL-статус, т.к. именно он определяет взаимодействие клеток в иммунном ответе и в конечном итоге уровень АТ той или иной специфичности, того или иного класса.

Разработанная нами методология исследования АТ может представляться перспективной для изучения иммунохимических механизмов адаптации человека к низкомолекулярным ксено- и эндобиотикам в комплексе с анализом ферментов их биотрансформации, ферментов репарации ДНК, HLA- и IL-статусов организма. С практической точки зрения наиболее информативными в определении риска РЛ у курящих мужчин представляются анализы IgA-БП, IgG-ПГ, IgG-ЭС и IgG-ПГ с расчетом соотношений IgA-БП/ПГ, IgG-БП/ПГ, IgG-ЭС/ПГ.

С учетом возможных экономических ограничений с этой целью может быть рекомендован анализ IgG-БП и IgG-ПГ с расчетом соотношения IgG-БП/ПГ. Анализ выполняется на одном планшете, с использованием только двух антигенов (БП-БСА, ПГ-БСА) и одного пероксидазного конъюгата против IgG человека. При величине соотношения IgG-БП/ПГ>2 достигается максимальная разница между больными и здоровыми (χ2=41,7,  р=0,0005), максимальный показатель прогностической значимости (AUC=0,92) и риск РЛ (OR=11,8). При IgG-БП/ПГ≤2 риск РЛ снижается до 0,08.