Влияние липополисахарида из клеток Salmonella typhi на кровообращение и дыхание анестезированной крысы

Введение. Клеточная стенка грамотрица-тельных бактерий, входящих в состав микрофлоры кишечника, является источником липополисахарида (ЛПС), который постоянно присутствует в системном кровотоке и в нормальных условиях эффективно нейтрализуется антиэндотоксическими системами. Нарушение барьерной функции кишечника и массовое разрушение бактерий приводят к повышению системного уровня ЛПС. При попадании в системный кровоток ЛПС взаимодействует с циркулирующим ЛПС-связывающим белком, а затем с рецепторным комплексом

CD14/TLR4/MD-2, расположенным на поверхности иммунокомпетентных клеток. Это приводит к быстрой активации внутриклеточного сигнального пути, включению генов ядерного фактора каппа В (NF-kB) и усиленному синтезу провоспалительных цитокинов IL-1 и ФНО [1, 2]. В клинической картине развивающегося системного воспалительного ответа (СВО) доминируют сердечно-сосудистая и дыхательная дисфункции, которые проявляются, в частности, в изменении АД, тахикардии и гипервентиляции [3, 4]. Считается, что эндотоксическая активность ЛПС определя- ется главным образом одним из его компонентов, липидом А, который у разных видов бактерий отличается длиной, положением и количеством цепей жирных кислот. В частности, липиды А, входящие в состав ЛПС клеточной стенки Escherichia и Salmonella, являются бифосфорилированными, имеют асимметричное распределение жирных кислот, но различаются по их количеству. В состав липида А из Escherichia coli (E. coli) входит 6 жирных кислот, а в состав липида А из Salmonella typhi (S. tуfi) – 7 жирных кислот. MD-2 различает эту особенность структуры липида А и, в зависимости от неё, по-разному активирует TLR4 [2, 5, 6]. Кроме того, установлено, что и другие структурные компоненты ЛПС, которые отличаются у разных бактерий, могут влиять на эндотоксическую активность ЛПС [7]. Эти данные позволяют предполагать, что повышение системного уровня ЛПС, происходящего из разных видов бактерий, может по-разному воздействовать на продукцию цитокинов и, как следствие, оказывать различное влияние на функции систем дыхания и кровообращения при развитии СВО.

К настоящему времени установлено, что системное введение ЛПС приводит к повышению уровня провоспалительных цитокинов, в частности ФНО [8–12], и вызывает изменение артериального давления и повышение ЧСС [11, 12]. Кроме того, показано, что провоспа-лительные цитокины при повышении их системного и церебрального уровня изменяют паттерн внешнего дыхания, оказывают угнетающее действие на рефлекторные механизмы системы дыхания [13–18]. Установлено также, что эти эффекты реализуются посредством NO-ергических и простаноидзави-симых механизмов [16–18].

Таким образом, кардиореспираторные эффекты ЛПС, а также механизмы их реализации изучены достаточно подробно. Вместе с тем анализ литературных данных показывает, что особенности кардиореспираторных эффектов, которые могут проявляться в результате отличий в структуре ЛПС, выделенного из разных видов бактерий, практически не исследовались.

Цель исследования. Экспериментальная проверка предположения о том, что ЛПС, вы- деленный из клеток бактерии S. tуfi, может оказывать влияние на рефлексы, участвующие в контроле кровообращения и дыхания.

Материалы и методы. Эксперименты были проведены на 23 самцах крыс линии Wistar массой 200–225 г из ЦКП «Биоколлекция» ИФ РАН, анестезированных внутрибрюшинным введением уретана в дозировке 1800 мг/кг. Температура тела животных в ходе опытов поддерживалась на уровне 37±0,5 ºC. Содержание лабораторных животных, уход за ними, а также организация всех экспериментальных процедур осуществлялись в соответствии с Приложением А к Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях (ETS N 123).

Животные были разделены на две группы: контрольную (n=11) и экспериментальную (n=12). Хирургическая подготовка животного к эксперименту включала трахеостомию, катетеризацию бедренной артерии и вены, а также установку электромиографиче-ских электродов на реберную часть диафрагмы. К трахеостоме присоединялась пнев-мометрическая трубка, к артериальному катетеру – переходная камера датчика давления. Электроды, трубка и датчик подключались к предусилителям, которые формировали сигналы электромиограммы, пневмотахограммы и артериального давления. Cигналы поступали на вход устройства сбора данных PowerLab 8/32, работавшего под управлением пакета программ LabChart 7. Этот аппаратнопрограммный комплекс (AD Instruments, New Zealand) обеспечивал мониторинг и регистрацию артериального давления (АД), пневмотахограммы (ПТГ) и электромиограммы диафрагмы (ЭМГди). Кроме того, с его помощью производился расчёт и регистрация среднего артериального давления (АДср), частоты сердечных сокращений (ЧСС), дыхательного объема (ДО), частоты дыхания (ЧД), длительности вдохов (Тi) и минутного объема дыхания (МОД) в режимах on- и offline. Инспираторно-тормозящий рефлекс Геринга–Брейера (ИТР) оценивался методом функциональной ваготомии, который реализуется путем окклюзии верхних дыхательных путей в конце выдоха. Сила ИТР характеризовалась про- центным соотношением длительности первого окклюзионного «вдоха» и длительности последнего свободного вдоха перед окклюзией [18, 19], причем длительности вдохов определялись по ЭМГди. Тестирование артериального барорефлекса (БР) осуществлялось путем болюсного введения α-адреномиметика фенилэфрина в дозировке 0,05 мг/кг. Затем средствами программного пакета MS Excel определялся угловой коэффициент а в уравнении линейной функции y=ax+k, аппроксимирующей зависимость между ростом АДср и падением ЧСС. Величина a определяет наклон аппроксимирующей прямой линии и отражает силу БР: коэффициент увеличивается при усилении и уменьшается при ослаблении БР. Через час после начала эксперимента контрольным животным вводилось 2 мл физиологического раствора. Животным основной группы также через час вводилось 2 мл раствора, содержащего ЛПС, выделенный из клеток бактерии S. typhi (препарат «Пирогенал», пр-во «Медгамал», Россия), в дозировке 0,9 мг/кг. Общая длительность эксперимента составляла 3 ч. По завершении эксперимента животные усыплялись передозировкой анестетика. Значения величин определялись с интервалом 10 мин и нормировались относительно их фоновых значений на 60-й мин эксперимента, перед введением раствора. Тестирование БР производилось каждые 30 мин и нормировалось относительно 40-й мин.

Статистическая обработка данных производилась при помощи пакетов программ MS Excel и Statistica for Windows. Рассчитывались средние значения абсолютных и нормированных величин и ошибки средних. Полученные величины сводились в таблицы и использовались для построения графиков. Значения учитываемых параметров после введения ЛПС сравнивались со значениями, полученными непосредственно перед введением ЛПС (фоновые значения), а также со значениями, полученными в контрольных экспериментах. Для определения достоверности наблюдавшихся изменений использовался непараметрический критерий Манна–Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.

Результаты. Эксперименты показали, что к 60-й мин от начала регистрации показа- тели, характеризующие состояние систем кровообращения и дыхания, стабилизировались, поскольку не было обнаружено достоверных различий между их значениями на 20-й, 40-й и 60-й мин. Кроме того, не было обнаружено достоверных различий между их значениями, полученными в контрольных экспериментах и в экспериментах с введением ЛПС (табл. 1).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение физиологического раствора не оказывало статистически значимого влияния на величину АД ср (рис. 1а). Вместе с тем через 40 мин после введения раствора, содержащего ЛПС, наблюдалось статистически значимое увеличение величины АД ср по сравнению с его фоновыми показателями, которое сохранялось и на 120-й мин. Затем значения АД ср возвращались к исходным величинам и не отличались от значений, полученных в контрольных экспериментах.

ЧСС была стабильна в контрольных экспериментах и начинала возрастать после введения ЛПС (рис. 1б). На 120-й мин ЧСС была достоверно выше фоновых и контрольных значений и продолжала расти до конца эксперимента.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛПС при его внутривенном введении оказывает влияние на систему кровообращения, повышая ЧСС.

В контрольных экспериментах ДО оставался относительно стабильным, не обнаруживая каких-то определенных изменений (рис. 2а). В то же время ЛПС вызывал небольшое, но статистически значимое увеличение ДО начиная со 120-й мин эксперимента, т.е. через 60 мин после введения вещества (рис. 2а). При этом достоверных отличий между величинами ЧД, полученными в этих сериях экспериментов, получено не было. МОД в контрольной серии экспериментов был стабилен, несколько снижаясь к концу эксперимента (рис. 2б). Напротив, после введения ЛПС наблюдался постепенный рост МОД. На 140-й мин и до конца эксперимента величина МОД была достоверно больше его фоновых и контрольных значений. Очевидно, что введение ЛПС приводило к увеличению вентиляции, главным образом за счет роста ДО.

Таблица 1

Table 1

Абсолютные величины учитываемых показателей до введения контрольного и экспериментального растворов

Absolute values of relevant indicators before control and experimental solution administration

Показатели Parameters	Группа Group	10-я мин 10th min	20-я мин 20th min	40-я мин 40th min	60-я мин 60th min
АД ср , мм рт. ст. Mean ABP, mm Hg	контрольная control	76±4	73±4	72±2,8	73±3
	экспериментальная experimental	67±4	66±3	62±34	68±3
ЧСС, уд./мин HR, BPMs	контрольная control	359±15	362±12	375±12	385±14
	экспериментальная experimental	397±14	400±13	404±10	407±14
ЧД, ц/мин RF, min-1	контрольная control	114±5	108±6	109±5	111±6
	экспериментальная experimental	120±6	122±7	123±10	122±6
ДО, мл TVe, ml	контрольная control	1,5±0,2	1,6±0,2	1,5±0,2	1,5±0,2
	экспериментальная experimental	1,9±0,3	2,0±0,4	1,8±0,2	1,9±0,3
МОД, мл/мин RMVe, ml/min	контрольная control	157±21	168±19	160±17	164±17
	экспериментальная experimental	235±53	241±55	221±60	236±53
Тi оккл, % Ti occl, %	контрольная control	142±6	140±6	140±3	148±4
	экспериментальная experimental	150±7	159±9	143±4	153±5
Коэффициент а Coefficient a	контрольная control	1,6±0,12	-	1,6±0,19	-
	экспериментальная experimental	1,5±0,18	-	1,5±0,12	-

а

а

б b

10  20  40  80  100 120 140 160 180время мин, time min

□    Контрольная группа Сontrol group^ Экспериментальная группа Еxperimental group

Рис. 1. Изменения АД ср (а) и ЧСС (б) в экспериментальной и контрольной группах. Стрелка – момент введения растворов.

• #    – достоверные отличия от фоновых значений при p<0,05;

* – достоверные отличия от фоновых и контрольных значений при p<0,05.

На рис. 2 и 3 обозначения те же

Fig. 1. Changes in mean blood pressure (a) and heart rate (b) in experimental and control groups. Arrow points the moment of injection.

• #    – the differences from the background values are significant at p<0.05;

• * – the differences from the background and control values are significant at p<0.05 The designations in Fig. 2 and 3 are the same

  а

  а

  
  
  
  
  
  
  

  б b

  
  

  ш

  
  
  
  
  
  

  О

  
  
  
  
  
  
  
  
  

10  20  40  80  100 120 140 160 180время мин, time min

□ Контрольная группа Control groupЭкспериментальная группа Experimental group

Рис. 2. Изменение ДО (а) и МОД (б) в контрольных экспериментах и в экспериментах с введением ЛПС

Fig. 2. Changes in tidal volume (TVe) (a) and respiratory minute volume (RMVe) (b) in control experiments and in experiments with LPS administration

Тестирование БР в контрольных экспериментах и в экспериментах с введением ЛПС показало, что начальные значения показателя силы этого рефлекса, определенные до введения раствора, на 40-й мин эксперимента, составляли соответственно 1,6±0,2 и 1,4±0,4. Эти величины не имели достоверных отличий между собой; при нормировании данных, полученных в соответствующих сериях экспериментов, они были приняты за 100 % (рис. 3а). После введения физиологического раствора наблюдалось усиление барорефлекса, которое не было, однако, статистически значимым. Под влиянием ЛПС про- исходило достоверное ослабление барорефлекса (рис. 3а).

Тестирование ИТР показало его стабильность в контрольных экспериментах и постепенное ослабление после введения ЛПС (рис. 3б). Через 40 мин после введения показатель силы ИТР уменьшался до величины, статистически значимо отличавшейся от фоновых и контрольных значений, и продолжал постепенно снижаться вплоть до конца эксперимента. Таким образом, полученные результаты показали, что влияние ЛПС на рефлекторные механизмы регуляции систем кровообращения и дыхания проявляется в их ослаблении.

а

а

б b

Контрольная группа/Control groupЭкспериментальная группа/Experimental group

Рис. 3. Изменение силы БР (а) и ИТР (б) в контрольных экспериментах и экспериментах с введением ЛПС

Fig. 3. Changes in the power of baroreflex (a) and inspiratory-inhibitory reflex (IIR) (b) in control experiments and in experiments with LPS administration.

Обсуждение. Итак, в результате проведенных экспериментов было установлено, что системное введение ЛПС, выделенного из клеток бактерии S. typhi , вызывает повышение ЧСС и МОД у крыс, анестезированных уретаном. Кроме того, происходит ослабление двух важных рефлекторных механизмов, участвующих в контроле функций кровообращения и дыхания, а именно БР и ИТР. Нашими предыдущими исследованиями было установлено, что подобные эффекты вызывает введение

ЛПС, выделенного из клеток E. coli [21]. При системном введении этого вещества анестезированным крысам происходило повышение ЧСС, увеличение ДО и МОД, а также ослабление барорефлекса и инспираторно-тормозящего рефлекса. Вместе с тем следует отметить, что ЛПС из E. coli вызывал снижение АД, а в экспериментах с ЛПС из S. typhi мы не наблюдали снижения АД. Напротив, через 40 мин после введения вещества отмечалось временное увеличение АД ср , а ещё через

40 мин уровень АД ср возвращался к исходным значениям. Это различие могло быть вызвано разницей в дозировках, применявшихся при исследовании ЛПС разного происхождения. По-видимому, следует признать, что по основным параметрам, ЧСС и вентиляции, а также по рефлекторным механизмам циркуляторная и респираторная системы крысы, анестезированной уретаном, сходным образом реагируют на ЛПС, выделенный из разных видов бактерий.

С одной стороны, известно, что несмотря на то что механизмы действия липополисахаридов на иммунокомпетентные клетки могут изменяться в зависимости изменений в структуре их молекулы, конечным результатом будет выделение провоспалительных цитокинов, в частности ФНО [8]. С другой стороны, в предыдущих экспериментах на крысах, анестезированных уретаном, нами было установлено, что экзогенное повышение системного уровня ФНО усиливает вентиляцию за счет роста ДО и ослабляет инспираторно-тормозящий рефлекс [18]. Было показано, что эти эффекты устраняются диклофенаком, который оказывает ингибирующее действие на проста-гландин-эндопероксид синтазу (КФ 1.14.99.1, циклооксигеназа (ЦОГ)). Поскольку, кроме того, известно, что ФНО вызывает экспрессию ряда белков, включая ЦОГ, был сделан вывод о том, что респираторные эффекты, которые наблюдаются при повышении его системного уровня, являются следствием повышения системного уровня простагландинов и их действия на нервные механизмы регуляции дыхания. Таким образом, представляется вполне вероятным, что те изменения в функциях сердечно-сосудистой и респираторной систем, которые наблюдались в наших экспериментах в результате введения ЛПС из клеток S. tуfi , являются следствием повышения системного уровня ФНО, усиления синтеза ЦОГ и повышения уровня простагландинов.

Возможны и другие пути реализации наблюдавшихся нами эффектов, поскольку введение ЛПС вызывает продукцию не только ФНО, но и других провоспалительных цитокинов, в частности интерлейкина-1-бета (ИЛ-1β). Установлено, что экзогенное повышение системного уровня ИЛ-1β приводит к изменению состояния респираторной системы анестезированной крысы, причем его эффекты также реализуются посредством простаноид-зависимых механизмов [15, 16]. В свою очередь простагландины выступают в роли ингибирующих модуляторов, оказывающих своё действие на уровне продолговатого мозга, в цепях нейронов, осуществляющих контроль дыхания и кровообращения [21, 22].

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что экзогенное повышение системного уровня ЛПС, выделенного из бактерии S. tуfi , взывает изменения в состоянии систем дыхания и кровообращения крысы, анестезированной уретаном. Эти изменения проявляются в тахикардии, усилении вентиляции и ослаблении рефлекторных механизмов регуляции систем дыхания и кровообращения. Подобные изменения наблюдались при моделировании СВО путем введения ЛПС из клеток E. coli , а также при экзогенном повышении системного уровня ФНО на том же объекте в аналогичных экспериментальных условиях. Поэтому вероятно, что обнаруженные эффекты ЛПС, выделенного из S. tуfi , также реализуются при посредничестве ФНО, который вызывает рост циклооксигеназной активности и, соответственно, усиление синтеза простагландинов. Таким образом, можно полагать, что в условиях модельных экспериментов на анестезированных животных ЛПС, выделенные из разных источников, несмотря на разницу в тонком строении их молекул, оказывают сходное действие на функции дыхания и кровообращения, в т.ч. на рефлекторные механизмы их регуляции.