Влияние микроорганизмов-деструкторов углеводородов на токсичность загрязненного нефтью чернозема

В регионах, где идет добыча и переработка нефти, загрязнение почв углеводородами является серьезной экологической проблемой. По степени вредного влияния на экосистемы нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие промышленные отходы занимают второе место после радиоактивного загрязнения [1]. Естественное восстановление физических, химических и биологических свойств нефтезагрязненных почв может длиться несколько десятков лет.

Существенную помощь в решении вопроса очистки территории от нефти могут оказать биологические средства. Микробиологические методы способны дополнять технические способы, а в определенных ситуациях не имеют альтернативы [2]. Преимуществом биологических способов обезвреживания является высокая степень утилизации загрязнителя, снижение антропогенной нагрузки на нарушенную экосистему за счет использования естественных природных ресурсов [3-4]. Поэтому, биологические методы очистки экономически значительно выгоднее, хотя их применение и ограничено весенне-летним периодом.

Биодеградация углеводородов нефти природными микробными популяциями представляет один из основных механизмов, с помощью которого нефть может быть деградирована или трансформирована в окружающей среде. Ряд современных технологий биологической очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами предусматривает введение экзогенных микробов или активизацию эндемичной (почвенной) микробиоты [4].

Восстановление растительных сообществ на месте нефтеразлива является обязательным завершающим этапом любой технологической схемы реабилитации загрязненных углеводородами земель. Однако даже на этом этапе рекультивации растения могут испытывать негативное влияние накопив-

шихся в почве токсичных соединений, отставать в росте, быть уязвимыми для фитопатогенов. В ряде исследований обнаружена тенденция к накоплению в загрязненной почве фитопатогенных и фитоток-сичных микроскопических грибов [5-6]. Основной причиной этого является смещение экологического равновесия в едином взаимосвязанном микробном сообществе почв под воздействием углеводородов. Изменяется как частота встречаемости отдельных видов микромицетов и бактерий, так и соотношение грибного и бактериального компонентов сообщества. Например, было показано, что нефтяное загрязнение почвы приводило к изменению численности бактерий в ризосфере пшеницы и ячменя и меняло структуру их комплекса [7]. После нефтяного загрязнения в торфяно-глеевых почвах Республики Коми менялась численность микроорганизмов разных физиологических групп и структура комплекса микроскопических грибов [8]. Под влиянием загрязнения происходила существенная перестройка комплекса организмов чернозема обыкновенного, изменение структуры доминирования. При этом наблюдалось снижение разнообразия микроскопических грибов и рост разнообразия бактерий [9].

Поэтому поиск микроорганизмов – деструкторов нефти, благоприятно влияющих на состав микробного сообщества и прорастание семян в нефтезагрязненной почве, является актуальной задачей.

Целью данной работы было исследование процесса детоксикации загрязненного нефтью чернозема после интродукции в него окисляющих углеводороды микроорганизмов.

Исследования проводили в условиях модельного эксперимента на образцах чернозема выщелоченного. В качестве загрязнителя использована товарная нефть Угутского месторождения (температура начала кипения 85ºС, содержание серы 1,1 мас.%) в концентрации 5%, 10% и 15% от веса грунта. Через пять суток после загрязнения грунт был обработан в количестве 5 мл/кг биопрепаратом «Ленойл» с титр 109 КОЕ/мл. В качестве альтерна- тивы использована бинарная культура микроорганизмов Pseudomonas sp. ИБ НД1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД1.2 с титром 109 КОЕ/мл, выделенная в лаборатории биологически активных веществ Института биологии УНЦ РАН. Почву инкубировали в емкостях по 2 кг при температуре воздуха 18-20°С в течение 90 сут.

Содержание углеводородов в грунте определяли гравиметрически. Выделение и количественный учет микроорганизмов проводили по общепринятым методикам на питательных средах: микроми-цетов – на среде Чапека, деструкторов углеводородов – на среде Цукамуры [10]. Длину гиф грибного мицелия в 1 г почве измеряли в процессе микроскопирования мембранных фильтров, после осаждения на них почвенной взвеси [11]. Идентификацию видов микромицетов проводили по определителям [12-15]. Видовые названия микроскопических грибов уточняли по пополняемым спискам опубликованных видов в базе данных «Species fun- gorum» (. Фитотоксичность грунта оценивали по всхожести семян кресс-салата, разложенных на его поверхности.

Определение остаточного содержания углеводородов в почве через 90 сут инкубации показало, что разложение углеводородов протекало неодинаково в разных вариантах опыта (рис. 1). Выявлено положительное влияние интродукции окисляющих углеводороды бактерий на деструкцию нефти. Статистически достоверных отличий между почвами с внесением биопрепарата «Ленойл» и бинарной культуры Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococ-cus sp. ИБ НД 1.2 обнаружено не было. Максимальное остаточное содержание углеводородов наблюдалось в контрольных вариантах опыта без дополнительных обработок.

Рис. 1 Содержание остаточных углеводородов в почве на 90-е сут опыта

Численность в почве окисляющих углеводороды микроорганизмов может служить косвенным показателем активности процесса микробного окисления нефти. Определенная методом посева на твердую питательную среду с дизельным топливом она была выше в вариантах опыта с интродукцией бактерий - деструкторов (табл. 1). Она была чуть ниже в почве, загрязненных нефтью в концентрации 15%, что, по-видимому, объясняется токсичным действием углеводородов. Существенных отличий в численности микроорганизмов между вариантами опытов с использованием разных микроорганизмов - деструкторов выявлено не было.

Таблица 1 . Численность окисляющих углеводороды микроорганизмов в рекультивированной почве, КОЕ/г

Микроорганизмы	Концентрация нефти, %
	5	10	15
Без биопрепарата	(8,0±0,9)∙106	(5,0±0,6)∙106	(2,7±0,2)∙105
«Ленойл»	(3,1±0,5)∙107	(2,6±0,7)∙108	(4,0±0,8)∙106
Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2	(7,9±0,3)∙108	(8,3±0,5)∙107	(1,5±0,6)∙106

Рекультивация в значительной степени способствовала снижению токсичности загрязненного грунта (рис. 2). Обнаружено, что фитотоксичность загрязненных почв по отношению к семенам кресс-салата после обработки культурой Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 была ниже, чем после обработки биопрепаратом «Ленойл». Стимулирующее влияние интродукции изучаемой культуры микроорганизмов на прорастание семян кресс-салата проявлялось в вариантах с разной исходной концентрации нефти. При 5% и 10% начальном содержании нефти после добавления куль- туры Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 количество взошедших семян было таким же, как на пропитанной водой фильтровальной бумаге. Многие семена и проростки на загрязненной почве без искусственного введения деструкторов поражались грибным мицелием.

Рис. 2 Всхожесть семян кресс-салата на загрязненной и рекультивированной почве

Поскольку остаточное содержание нефти в вариантах опыта с разными микроорганизмами отличалось несущественно, было предположено, что неблагоприятное влияние загрязненной почвы на семена кресс-салата объяснялось не только присутствием в ней углеводородов, но также фитопато-генных или фитотоксичных микромицетов.

При изучении комплекса почвенных микроскопических грибов были использованы такие показатели как длина мицелия в 1 г почвы и его видовой состав. Было обнаружено относительно невысокое содержание грибного мицелия в незагрязненном грунте – 27,5±4,4 м/г. Нефтяное загрязнение в концентрации 5% и 10% вызывало значительное увеличение этого показателя, тогда как при концентрации 15% этот показатель увеличивался незначительно (табл. 2). Гораздо меньше мицелия обнаруживалось после рекультивации, возможно за счет вытеснения его бактериальной составляющей ценоза. Более выраженное антигрибное влияние оказывала интродукция культуры Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2.

Таблица 2 . Длина грибных гиф в загрязненной и рекультивированной почве, м/г

Микроорганизмы	Концентрация нефти, %
	5	10	15
Без биопрепарата	121,5±7, 4	119,1±21, 0	59,3,±9, 5
Ленойл	64,0±6,8	71,3±4,0	43,0±3,9
Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 .	22,0±4,2	28,8±5,0	16,4±2,7

Анализ таксономической принадлежности выделенных из незагрязненной почвы грибных изоля-тов показал доминирование среди них представителей рода Penicillium , что является обычным для почв данного типа (рис. 3). Загрязнение почв нефтью, а также их рекультивация приводили к существенным изменениям в комплексе микроскопических грибов чернозема. В частности, в загрязненных почвах возрастала доля грибов, принадлежащих к родам Fusarium и Aspergillus , что, возможно, связано с наличием у них углеводородокисляющей способности. Из использованных для интродукции микробных культур Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 в большей степени, чем «Ленойл» влияли на видовой состав почвенных микромицетов, значительно снижая долю представителей рода Fusarium . В связи с этим была проверена антагонитическая активность данной культуры по отношению к грибам рода Fusarium.

Одновременный посев газона микромицета Fusarium oxysporum и внесение культуры бактерий вызывало образование зон, в которых замедлялся рост грибных гиф, радиусом 1,5-2 см. Зоны полного подавления грибного роста не наблюдались. Т.е. культура Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 обладала фунгистатической активностью.

Таким образом, внесение окисляющей углеводороды культуры Pseudomonas sp. ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 может подавлять развитие грибов рода Fusarium в нефтезагрязненной почве. Ее применение может быть целесообразно в том случае, если озеленение загрязненного грунта проводится в один вегетационный сезон с внесением биопрепарата – нефтедеструктора. Возможность использования этого данной культуры в процессе фитомелиорации требует дальнейших исследований.

Рис. 3 Соотношение микроскопических грибов, принадлежащих к разным родам в незагрязненной почве и почве, загрязненной нефтью в концентрации 10%

• 1.    Черняховский Э.Р., Шкидченко А.Н., Юматова О.А., Чушкина З.Ю . Применение различных технологий при ликвидации последствий аварийных разливов нефти, нефтепродуктов и продуктов переработки нефтесодержащих отходов // Проблемы безопасности и чрезвычайных ситуаций. 2004. № 6. С. 18-23.

• 2.    Калюжин В.А. Биодеградация нефти // Исследования эколого-географических проблем природопользования для обеспечения территориальной организации и устойчивости развития нефтегазовых регионов России: Теория, методы и практика. Нижневартовск: НГПИ, 2002. С. 229-230.

• 3.    Павлов П.В., Соколова А.С . Проектные решения по рекультивации нефтезагрязненных земель // Нефтяное хозяйство. 2002. № 7. С. 66-67.

• 4.    Логинов О.Н., Силищев Н.Н., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф . Биорекультивация. Микробиологические технологии очистки нефтезагрязненных почв и техногенных отходов. М.: Наука, 2009. 112 с.

• 5.    Киреева Н.А., Бакаева М.Д., Галимзянова Н.Ф . Влияние различных способов биоремедиации нефтезагрязненных почв на характеристику комплекса микромицетов // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. № 1. С. 63-68.

• 6.    Марфенина О.Е . Антропогенные изменения комплексов микроскопических грибов в почвах: Автореф. дис. …д-ра биол. наук. М: МГУ, 1999. 48 с.

• 7.    Киреева Н.А., Новоселова Е.И., Григориади А.С. Влияние загрязнения почв нефтью на физиологические показатели растений и ризосферную микробиоту // Агрохимия. 2009. № 7. С. 71-81.

• 8.    Киреева Н.А., Рафикова Г.Ф., Щемелинина Т.Н., Марка-рова М.Ю . Биологическая активность загрязненных нефтью и рекультивируемых торфяно-глеевых почв Республики Коми // Агрохимия. 2008. № 8. С. 68-75.

• 9.    Колесников С.И., Казеев К.Ш., Велигонова Н.В., Патрушева Е.В., Азнаурьян Д.К., Вальков В.Ф. Изменение комплекса почвенных микроорганизмов при загрязнении чернозема обыкновенного нефтью и нефтепродуктами // Агрохимия. 2007. № 12. С. 44-48.

• 10.    Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусо-ва. М.: Издательский центр Академия, 2005. 608 с.

• 11.    Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохиии. М: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.

• 12.    Билай В.И. Фузарии. Киев: Наукова думка, 1977. 442 с.

• 13.    Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л: Наука, 1967. 302 с.

• 14.    Пидопличко Н.М . Пенициллии. Киев: Наукова думка, 1972. 150 с.

• 15.    Watanabe T . Pictorial atlas of soil and seed funfi: Morphologies of cultured fungi and key to species. Florida, 2000. 411 p.

INFLUENCE OF MICROORGANISMS–DESTRUCTORS OF HYDROCARBONS ON TOXICITY OF THE OIL POLLUTED CHERNOZEM