Влияние мутации A82G в гене MMP-12 и C634G в гене VEGF-a на течение варикозной болезни нижних конечностей и риск развития рецидива заболевания

Варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) зачастую приводит к развитию хронической венозной недостаточности (ХВН), что характеризуется появлением расширенных и извитых подкожных вен нижних конечностей при этом возраст и семейный анамнез считаются важными факторами риска [1–3], с подавляющим большинством клинических и патологических проявлений, от ограниченного дискомфорта в ногах до отёка и незаживающих язв [4–6].

Варикозное расширение вен определяется с C2 в клинической классификации клинических, этиологических, анатомических и патофизиологических (CEAP) хронических венозных заболеваний [3]. Несмотря на многофакторный патогенез варикозного расширения вен, генетические факторы и факторы окружающей среды остаются недостаточно изученными [7].

При ХВН некоторые наследственные факторы могут играть важную роль в развитии заболевания, включая постоянное ухудшение состояния венозной стенки из-за мутаций генов, способствующих деформации стенки вены с гипертрофией мышечного слоя, изменением структуры внеклеточного матрикса [8] и персистирующей венозной гипертензией [9].

Полиморфизмы генов, способствующие ремоделированию венозной стенки, до сих пор изучены мало. Эти ассоциации могут иметь будущее прогностическое и терапевтическое значение. Важные гены/белки-кандидаты включают MMP – металлопротеиназы матрикса (деградация внеклеточного матрикса), VEGF – факторы роста эндотелия сосудов (ангиогенез и целостность сосудистой стенки), FOXC2 (развитие сосудов), гемохроматоз (участвующий в венозных изъязвлениях и абсорбции железа) и различные типы коллагена, влияющие на прочность стенок вен и FRF – фактор роста фибробластов, способствующий деградации венозной стенки [10].

У больных ВБНК отмечены генетически сниженная способность к сокращению гладкомышечных клеток стенок вен, их ремоделирование за счёт повышенного синтеза матриксного Gla-белка, гиперпродукции TGF-β1, ингибитора матриксной металлопротеиназы, гипергомоци-стеинемия и мутации в генах, кодирующих синтез тромбомодулина. Варикозная трансформация вен считается малым феноменом недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ), приводящим к разрушению их стенок за счёт аномалий волокнистых структур и внеклеточного матрикса (ВКМ). Подтверждение роли НДСТ в развитии варикозной болезни позволит обеспечить индивидуальный подход к лечению пациентов и выбору адекватной послеоперационной терапии, направленной на предупреждение рецидива заболевания [11].

ХВН протекает с каскадом воспалительных реакций в мягких тканях нижних конечностей. На первом этапе развивается липодерматосклероз, при котором на фоне сохраненной структуры мягких тканей происходит увеличение площади капиллярного русла не за счёт возрастания их абсолютного количества, а в результате их удлинения и извитости [12, 13]. На этой стадии начинает вырабатываться сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) типа A [14]. Он стимулирует экспрессию эндотелио-цитами адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1 и E-селек-тина, которые опосредуют связывание лейкоцитов с эндотелием и способствуют их проникновению в ткань [12, 14, 15]. Помимо индукции синтеза адгезионных молекул, VEGF-A является мощным митогеном для эндотелиальных клеток, увеличивает проницаемость сосудов и регулирует экспрессию MMP и тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП). Циркулирующий белок VEGF впоследствии связывается с VEGF R-1 или VEGF R-2 рецептором на клетках эндотелия, стимулируя клеточный отклик, присоединяясь к рецепторам с тирозинкиназной активностью на поверхности клетки путём их трансфорилирования и, тем самым, способствуя ангиогенезу. Белки VEGF содействуют обеспечению кислородом тканей при пониженной циркуляции крови. Необходимо отметить, что избыточная экспрессия VEGF приводит к сосудистым изменениям в любых частях тела [16, 17], а средний уровень VEGF у пациентов с ХВН 3–4-го клинических классов статистически значимо выше, чем у здоровых людей [18].

Структура и функция стенки вены частично регулируются матриксными металлопротеиназами, представляющими собой цинк-зависимые эндопептидазы, которые секретируются в виде неактивных про-ММР различными клетками венозной стенки, включая фибробласты и лейкоциты. MMP регулируются на уровне экспрессии мРНК и путём активации удаления пропептидного домена из их латентной зимогенной формы. MMP разрушают различные белки ВКМ, включая коллаген и эластин, и могут влиять на другие клеточные процессы, включая эндотелий-опосре-дованную дилатацию, миграцию гладкомышечных клеток и их сокращение. Установлено, что повышенное венозное гидростатическое давление нижних конечностей увеличивает факторы, индуцируемые гипоксией, и другие индуцирующие MMP факторы. Это приводит к увеличению экс-прессии/активности MMP, деградации белка ВКМ, расслаблению стенки вены и её расширению. Модуляция эндогенных ТИМП и экзогенных синтетических ингибиторов MMP может обеспечить новые подходы к лечению ВБНК [19, 20].

MMP играют роль в ремоделировании сосудистой ткани во время различных биологических процессов, таких как ангиогенез, эмбриогенез, морфогенез и заживление ран. Изменения в специфических MMP могут влиять на ремоделирование артерий, значительное расширение вен и развитие заболеваний вен нижних конечностей.

MMP часто регулируются эндогенными ТИМП, а соотношение MMP/ТИМП определяет степень деградации белка ВКМ и ремоделирования ткани. ММР могут служить биомаркерами и потенциальными терапевтическими мишенями для определённых сосудистых заболеваний [21–23].

Необходимо отметить, что, несмотря на развитие новых методов лечения ВБНК, распространённость рецидива заболевания сохраняется в колоссальных пределах (7–80 %) у прооперированных пациентов [24].

Возможно, это связано с тем, что все используемые методы лечения применяются у пациентов со значимыми проявлениями заболевания и на более поздних стадиях развития ВБНК. Таким образом, накопленная в настоящее время внушительная научная информация не позволяет построить полную и непротиворечивую картину развития ВБНК и ХВН, и, поэтому, требуются дальнейшие разработки. С нашей точки зрения исследование мутации в генах MMP и VEGF-A является актуальным.

Цель исследования: создание способа прогнозирования развития варикозной болезни нижних конечностей и её рецидива.

Объект и методы

Проведено два независимых одноцентровых рандомизированных перспективных исследования, где нами была определена взаимосвязь мутаций в генах MMP-12 и VEGF-A с частотой возникновения рецидивов ВБНК. Протокол исследований был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (протокол № 212 от 11.11.2020). От каждого пациента было получено информированное согласие на участие в исследовании до выполнения каких-либо медицинских вмешательств, которое проводилось в соответствии с утверждённым протоколом и этическими принципами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Критерии включения пациентов в исследования: возраст 18 лет и старше, пол любой, подтверждённое врачом – сосудистым хирургом основное заболевание – варикозная болезнь нижних конечностей и рецидив основного заболевания.

Из исследования исключались пациенты с клиническим классом C1 по CEAP, врождённым варикозным расширением вен или посттромботическим синдромом, с наличием сопутствующей патологии в стадии декомпенсации и в остром периоде, заболеваниями опорно-двигательной системы, сахарным диабетом, беременностью в ходе исследования, заболеваниями свертывающей системы крови, а также лица с предшествующим тромбозом глубоких вен нижних конечностей.

Группу наблюдения составили 119 пациентов с ВБНК. Всем пациентам проведено клиническое обследование, включая дуплексное ультразвуковое исследование венозной системы нижних конечностей. Для исключения посттромботических изменений тщательно исследовалось состояние глубоких вен нижних конечностей. Рефлюкс поверхностной венозной системы, определяемый с помощью приёма дистальной компрессии, продолжительностью более 0,5 секунд, расценивали как патологический. Для классификации проявлений ВБНК использовали международную систему классификации клинической тяжести, этиологии, анатомии и патофизиологии по CEAP. Из исследования исключались пациенты с клиническим классом С1 по СЕАР и лица с посттромботическим синдромом или врожденным варикозным расширением вен. Описательная характеристика пациентов, включённых в исследования представлена в таблице 1.

В первом исследовании пациентам (n = 75) помимо клинического обследования и цветного допплеровского картирования магистральных вен нижних конечностей проводили геномный анализ венозной крови на мутацию A82G гена MMP-12. Средний возраст пациентов составил 43,7 ± 5,9 года, преобладали женщины – 55 (73,3 %). Длительность анамнеза от 2,5 до 34 лет. Пациенты с С2-С6 клиническими классами ВБНК были разделены на две группы.

В I группу (n = 17) вошли пациенты с рецидивом ВБНК. Всем пациентам ранее выполнялись оперативные вмешательства на поверхностных и перфорантных венах. Объём операции избирался с учётом выявленных гемодинамических нарушений: кроссэктомия и короткий стриппинг или лазерная абляция, удаление варикозно трансформированных притоков большой и малой подкожных вен методом минифлебэктомии. В II группу (n = 58) были включены не оперированные пациенты с ВБНК, диагностированной впервые.

Во втором исследовании пациентам (n = 44) помимо клинического обследования и цветного допплеровского картирования магистральных вен нижних конечностей проводили исследование венозной крови на мутацию гена VEGF-A. Средний возраст пациентов составил 55,5 ± 2,7 года, из них 13 (29,5 %) лиц молодого возраста, трудоспособных – 26 (59 %) человек. Как и в первом исследовании преобладали женщины – 34 (77,3 %). Длительность анамнеза составляла от 1,8 до 21 года. Все пациенты, вошедшие в исследование с ВБНК клинических классов С2–С6 по СЕАР, также были рандомированы на две группы: I группа (n = 5) – ранее оперированные пациенты с рецидивом ВБНК и II группа (n = 39) – пациенты с впервые установленным диагнозом ВБНК.

Для выделения DNA (дезоксирибонуклеиновая кислота) во всех исследованиях использовался «классический» фенол-хлороформный метод. Принцип метода заключался в разделении фаз раствора DNA и фенол-хлороформной смеси и удалении вместе с фенольной и хлороформными фазами белков и полисахаридов, который обеспечивал большой выход DNA. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с аллель-специфичными праймерами в формате реального времени позволяла эффективно и качественно определять мутацию в геномных DNA у обследуемых пациентов. При ПЦР-генотипировании полиморфизма A82G гена MMP-12 могут выявляться следующие генотипы: A/A (гомозигота по первой аллели), A/G (гетерозигота), G/G (гомозигота по второй аллели), а полиморфизма C634G гена VEGF-A генотипы: C/C (гомозигота по первой аллели), C/G (гетерозигота), G/G (гомозигота по второй аллели).

Результаты исследования

При ПЦР-генотипировании полиморфизма A82G гена MMP-12 нами выявлены следующие генотипы: A/A (гомозигота по первой аллели), A/G (гетерозигота). При оценке методом цветного допплеровского картирования магистральных вен оценивалось состояние клапанного аппарата глубоких и поверхностных вен, стенок венозных сосудов и окружающих их мягких тканей поражённой конечности. В результате ЦДК было установлено, что у пациентов, имеющих ген ММР-12 в гетерозиготном варианте, как I, так и II группы, присутствовала дилатация берцовых вен или подколенной вены (диаметр сосудов 6,4 ± 0,3 мм и 10,7 ± 0,24 мм соответственно) с клапанной недостаточностью подколенной вены и патологическим рефлюксом с замедлением венозной эвакуации.

Установлено, что у пациентов I группы, с рецидивом варикозной болезни, ген ММР-12 встречался в 80 % случаев (A/A, A/G вариации), тогда как во II группе – только в 33,3 % наблюдений в аналогичных вариациях. Критерий Пирсона χ ² = 10,4 (критическое значение – 6,63 при р < 0,01). Коэффициент корреляции Спирмена – 1,0 (критическое значение 0,398 при p < 0,05), используемый для определения зависимости ВБНК с частотой возникновения мутаций в гене MMP, – 12 (табл. 2).

При ПЦР-генотипировании полиморфизма C634G гена VEGF-A нами получены генотипы: C/C (гомозигота по первой аллели), C/G (гетерозигота). Генотип G/G у обследуемых пациентов обнаружен не был. Частота генотипов C/C и C/G у всех пациентов, вошедших во второе исследование составила 70,45 % и 29,55 % соответственно. В I группе пациентов, с рецидивом варикозной болезни, C/C и C/G составила 80 % и 20 % соответственно, а во II группе, с первично выявленным заболеванием, – 69,3 % и 30,7 %. Частота аллеля C соответствовала 85,23 %, а аллеля G – 14,77 %. С нашей точки зрения, полученные результаты подтверждают, что существует корреляция между группами пациентов с генотипом C/C и C/G – коэффициент корреляции Пирсона χ ² = 0,861 (p < 0,08) (табл. 2). Также были выявлена корреляция по клиническим классам С2-С6 ВБНК между I и II группами пациентов с C/C генотипом (коэффициент Пирсона χ ² = 0,799, p < 0,11) и корреляция между I и II группами пациентов с C/G генотипом (коэффициент Пирсона χ ² = 0,604, p < 0,28). Получена статистически значимая корреляция (коэффициент Пирсона χ ² = 0,917, при p < 0,01) в зависимости от длительности заболевания ВБНК между группами пациентов с генотипом C/C и C/G.

Таблица 1 . Описательная характеристика пациентов (n = 119) с варикозной болезнью нижних конечностей

Table 1. Descriptive characteristics of patients (n = 119) with varicose veins of the lower extremities

Переменная	Значения переменной
	Первое исследование	Второе исследование
Возраст (годы)	43,7 ± 5,9	55,5 ± 2,7
Пол, н. д. (%)
Мужчины	20 (26,7 %)	10 (22,7 %)
Женщины	55 (73,3 %)	34 (77,3 %)
Возраст начала ВБНК, n (%)
младше 20 лет	19 (25,3 %)	12 (27,3 %)
21–30 лет	36 (48,0 %)	21 (47,7 %)
31–40 лет	13 (17,3 %)	8 (18,2 %)
41–50 лет	5 (6,7 %)	2 (4,5 %)
старше 50 лет	2 (2,7 %)	1 (2,3 %)
Семейный анамнез, n (%)
Да	58 (77,3 %)	35 (79,5 %)
Нет	14 (18,7 %)	8 (18,2 %)
Н/Д	3 (4,0 %)	1 (2,3 %)
Класс CEAP, n (%)
С2	23 (30,7 %)	12 (27,3 %)
С3	37 (49,3 %)	21 (47,7 %)
С4	11 (14,7 %)	6 (13,6 %)
С5	3 (4,0 %)	4 (9,1 %)
С6	1 (1,3 %)	1 (2,3 %)

Таблица 2. Полученные мутации генов у пациентов (n = 119) первого и второго исследований

Table 2. Obtained gene mutations in patients (n = 119) of the first and second studies

Пациенты	Мутация генов				Критерий Пирсона χ 2	Значимость признака
	Гомозиготная вариация		Гетерозиготная вариация
	MMP 12 (A/A)	VEGF-A (C/C)	MMP12 (A/G)	VEGF-A (C/G)
n = 22 (1 этап – 17; 2 этап – 5)	50 %	80 %	30 %	20 %	10,4	0,01
n = 97 (1 этап – 58; 2 этап – 39)	13,3 %	69,2 %	20 %	30,7 %	0,861	0,08

Обсуждение

Из-за высокой распространённости ХВН, резкого омоложения пациентов с рассматриваемой патологией и значительного количества послеоперационных рецидивов заболевания в настоящее время уделяется пристальное внимание изучению связи ВБНК с геномом. Это направление будет способствовать переходу к персонализированной (персонифицированной) медицине – совокупность методов профилактики любого патологического состояния, в частности ВБНК, диагностики и лечения, основанных на индивидуальных особенностях каждого пациента. Это быстро развивающаяся область здравоохранения, основанная на интегрированном, координированном и индивидуальном для каждого пациента подходе к анализу возникновения и течения заболевания. Интегральная медицина, в первую очередь, включает разработку персонализированных средств лечения на основе геномики, тестирование на предрасположенность к болезням, профилактику, объединение диагностики с лечением и его мониторинг [25, 26]. Персонализированная медицина интегрирует генетическую и другую информацию о пациенте для предупреждения и лечения комплексных нарушений на основе наблюдений «от науки к клинике» [27]. Генетические, эпигенетические, транскриптомные, протеомные, метабо-ломные, метагеномные маркеры, совокупность вариативных фенотипических признаков (как всего организма па- циента, так его отдельных тканей и клеток) являются индивидуальными особенностями больного. Геномный пре-дикторный подход позволит предупредить развитие патологии вместо диагностики уже выраженного заболевания.

Проанализировав полученные данные, выявлена статистически значимая взаимосвязь полиморфизма гена ММР-12 с частотой рецидива ВБНК. Согласно полученным результатам частота в популяции людей с гетерозиготной мутацией в гене ММР-12 статистически значимо выше. Это может свидетельствовать о менее благоприятном прогнозе. Необходимо отметить, что различные полиморфизмы гена ММР-12 могут использоваться в качестве раннего диагностического маркера патологических изменений в стенке венозного сосуда и ВКМ. Поэтому, имея для анализа эти диагностические данные и результаты клинического обследования пациента, можно выбрать более правильную тактику лечения ВБНК или рекомендовать постоянные профилактические мероприятия, предупреждающие её развитие.

Понимание молекулярной основы возникновения и развития ВБНК, MMP-индуцированных функциональных изменений венозной стенки при данной патологии, с нашей точки зрения, даст ценную информацию о механизмах, связанных с развитием и прогрессированием сердечно-сосудистых заболеваний. Нами установлено, что корреляция между рецидивом ВБНК и его отсутствием в зависимости от клинического класса по CEAP для VEGF-A статистически не значима. Корреляция по длительности заболевания ВБНК между пациентами с генотипом C/C и C/G статистически значима. При более длительном течении ВБНК статистически значимо чаще происходят мутации в гене VEGF-A, отягощающее её течение.

Рецидив ВБНК является сложной задачей для врача и проблемой для пациента. Как показывает анализ литературных данных, внедрение в широкую клиническую практику разнообразных миниинвазивных, альтернативных классическому оперативному лечению, методов не привело к значимому снижению распространённости рецидива ВБНК. Поэтому необходим анализ и пересмотр подходов к интерпретации и лечению, возникающих после их применения, рецидивов. Необходим переход к персонифицированному подходу в лечении пациентов с ВБНК и особенно с проявлениями ХВН, что, несомненно, позволит улучшить результаты лечения этой патологии.

Заключение

Взаимосвязь полиморфизма гена MMP-12 с частотой рецидива ВБНК может служить предиктором развития патологических структурных изменений в стенке венозного сосуда и ВКМ, а мутация в гене VEGF-A возникает в основном при длительном анамнезе заболевания.