Влияние N-адамантоил-α-аминокислот и N-(пиридин- 4-ил)- 3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола на индуцированную агрегацию тромбоцитов

Производные аминокислот, в частности N -ацил- α -аминокислоты, вызывают постоянный интерес благодаря своему исключительно широкому спектру действия и чрезвычайно важной роли в жизнедеятельности клетки. Наличие в молекуле ацильного фрагмента придает этим соединениям гидрофобные свойства и позволяет проявлять поверхностно-активные и седативные свойства. Для лечения болезни Паркинсона известен лекарственный препарат допамантин N -(1-адамантилкарбонил)-3,4-ди-гидро-ксифенилэтиламин [1]. Химия и сведения по фармакологической активности N -адамантоилированных пептидов изложены лишь в нескольких публикациях [2-4]. Ранее было показано, что объемный адамантильный заместитель оказывается необходимым для увеличения сродства соединений к 5-HT 2 -рецепторам тромбоцитов [5, 6]. В данной статье изучено влияние двух N -адамантоил- α -аминокислот и производного триптамина на индуцированную серотонином агрегацию тромбоцитов.

Экспериментальная химическая часть. В качестве объектов для N-адаман-тоилирования были выбраны две аминокислоты — D,L-гистидин 2а и D,L-триптофан 2б, которые декарбоксилируются в организме до

Кленова Наталья Анатольевна, доктор биологических наук, профессор кафедры биологической химии Зарубин Юрий Павлович, кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры органической, био-органической и медицинской химии

Ширмаер Екатерина Федоровна, студентка Пурыгин Петр Петрович, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой органической, био-органической и медицинской химии биогенных аминов, и один биогенный амин – 2-(3´-индолил)этиламин (триптамин) для исследования действия на серотониновые рецепторы тромбоцитов. Известно два основных способа синтеза N-ациламинокислот — ацилирование аминокислот либо ацилирование их эфиров [7, 8]. Ацилирование аминокислот хло-рангидридами – один из наиболее распространенных методов для получения N-ациламинокислот. Он был положен в основу промышленного производства целой серии продуктов, например «медиаланов» — производных саркозина. Существуют различные модификации этого метода. Реакцию проводят в водных растворах, водно-органических смесях, содержащих 30-50% инертного водорастворимого органического растворителя и в системах двух несмешивающихся растворителей, одним из которых является вода. Следует отметить, что в последнем случае, например в системе вода–толуол, выход целевого продукта значительно снижается [7].

При исследовании кинетики ацилирования α -аминокислот бензоилхлоридом в водных растворах показано [8], что аминогруппа изучаемых аминокислот обладает высокой реакционной способностью, которая определяется формой ее существования в растворе. Наиболее реакционноспособными являются формы, имеющие свободные аминогруппы H 2 NCHRCOO^– (A) и H 2 NCH(R)COOH (B), при этом активность формы A выше. В воде реакции протекают медленно, в связи с чем увеличивается вероятность гидролиза амидной связи, особенно при нагревании.

Ацилирование D,L-триптофана осуществляли 1-адамантоилхлоридом в присутствии триэтиламина при нагревании в течение 17 ч в среде абсолютного толуола. Выход составил

37%. Нами установлено, что выход целевого продукта увеличивается при проведении реакции в водно-диоксановой среде. При адаман-тоилировании D,L-гистидина и D,L-трипто-фана в присутствии гидроксида натрия в среде диоксан/вода (1:1) найдено, что для повышения степени чистоты получаемого продукта необходимо соблюдение ряда условий (рН=10, температура не выше 25 C, интенсивное перемешивание в процессе добавления 1-адамантоилхлорида). Для выделения чистых веществ реакционную массу упаривают, экстрагируют спиртом, отгоняют растворитель и осадок очищают флаш-хроматографией.

NH 2

R CH COOH

1а,б

NaOH диоксан ; H2O

R CH COOH

2а,б

CH 2

NH б

При ацилировании гистидина 1а и триптофана 1б по методу Шоттен–Баумана в вод-но-диоксановой среде выход продукта увеличился до 53%, время реакции сократилось до 2 ч. Синтез 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)

индола 4 осуществлялся взаимодействием триптамина 3 в толуоле в присутствии триэти-ламина с хлорангидридом 1-адамантанкарбоновой кислоты по следующей схеме

При ацилировании 2-(3´-индолил) этила-мина 6 выход целевого продукта увеличивается по сравнению с триптофаном 3б. Это можно объяснить протонированием аминогруппы в D,L-триптофане 2б и дополнительным стерическим препятствием со стороны карбоксильной группы. В табл. 1 и 2 представлены время протекания реакций и данные ИК и ЯМР 1Н спектров полученных соединений.

В ИК спектрах соединений наблюдаются полосы поглощения сильной интенсивности 2908-2847 см-1 и 1720-1654 см-1, соответствующие валентным колебаниям связей С-H адамантанового ядра и С=O фрагмента амидных и карбоксильных групп. Также наблюдается поглощение ν(N–H) в области 3413-3217 см-1. В спектрах 1Н ЯМР наблюдаются три сигнала протонов каркаса адамантана в области 1.70–2.21 м.д., также присутствует сигнал протона у азота гетероцикла в области 8.40–8.88 м.д. (1Н). Полученные соединения исследованы на агрегационную активность в отношении тромбоцитов крови человека в присутствии серотонина.

Таблица 1. Температуры плавления, R_f, время протекания реакций и выходы соединений 1а, 1б, 4

	Название соединения	Т.пл., °С	R f	Время реакции, ч	Вы ход %
2а	N -(1-адамантоил)-D,L-гистидин	194–196	0,45*	2	55
2б	N -(1-адамантоил)-D,L-триптофан	84–86	0,64*	2	53
				17***	37***
4	3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индол	70	0,87**	5***	57***

Примечание: * - этанол, ** - этилацетат, *** - данные при проведении реакции в толуоле в присутствии триэтиламина

Таблица 2. Данные ИК и ЯМР 1 Н спектров для соединений 1а, 1б и 4

Соединение	ИК спектр, v , см-1		Спектр ЯМР 1 Н, 5 (м.д., от ТМС); J , Гц
	ν(C–H) Ad	ν (N–H), ν (C=O)	H Ad, H CH2	H Ar(Het) , H NH
1а	2904, 2847	3413, 1700, 1640	1.64 м (6H, CH 2 ), 1.76 д (6H, CH 2 ), 1.92 c (3H, CH), 2.92 м (2H, CH 2 ), 3.99 к (8 Гц, 1H, CH)	6.59 с (1H, Неt), 6.96 д (6 Гц, 1H, Het), 7.41 с (1H, NH), 8.43 c (1H, NH Нet)
1б	2908, 2850	3394, 3317, 1720, 1693, 1654	1.65 м (6H, CH 2 ), 1.76 м (6H, CH 2 ), 1.94 c (3H, CH), 2.80 с (2H, СН 2 ), 4.15 м (1H, CH)	6.96 м (1H, Het ), 7.04 м (1H, Het), 7.10 с (1H, Het), 7.27 м (1H, Het), 7.45 м (1H, Het), 7.53 м (1H, NH), 8.40 c (1H, NH, Het)
4	2908, 2850	3413, 3217, 1693, 1640	1.65 м (6H, CH 2 ), 1.76 м (6H, CH 2 ), 1.94 c (3H, CH), 2.79 т (7,8 Гц, 2H, СН 2 ) 3.30 к (7,8 Гц, 2H, СН 2 )	6.96 т (7,0 Гц, 1H, Het), 7.04 т (7,0 Гц, 1H, Het), 7.10 д (4 Гц, 1H, Het), 7.33 д (8 Гц, 1H, Het), 7.41 т (6 Гц, 1H, Het), 7.53 д (8 Гц, 1H, NH), 8.88 c (1H, NH Het)

Экспериментальная биологическая часть. Для выявления у исследуемых соединений синергетических свойств по отношению к серотониновым рецепторам нами проведены опыты с серотонином в качестве активатора агрегации. Для получения богатой тромбоцитами плазмы крови использовали свежеза-бранную донорскую кровь с 3,8% цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Кровь центрифугировали при 250 g , 10 минут, полученную плазму стандартизировали по количеству тромбоцитов, внося физиологический раствор (рН 7,2) до получения оптической плотности (600 нм, 1 см) 0,5 ед. Агрегацию тромбоцитов в присутствии исследуемых соединений исследовали фотометрическим методом Борна, основанном на определении оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами. В качестве агрегирующего агента использовали серотонина креатининсульфат фирмы «Merck» в конечной концентрации 1∙10^-5 M. Интенсивность агрегации оценивали по падению оптической плотности (600 нм, 1 см, СФ-46) за 30 минут и выражали в у.е.=∆ О.П. ×1000.

Результаты исследований и их обсуждение. Определяли изменения агрегирующей активности тромбоцитов при воздействии на них синтезируемых соединений 1а, 1б, 4 и серотонина креатинисульфата. Для серотонина на мембране тромбоцитов существует два типа рецепторов – ионные каналы и рецепторы, сопряжённые с G-белками, поэтому, являясь их лигандом, он может индуцировать процессы агрегации тромбоцитов двумя путями. Влияние соединений на скорость агрегации тром- боцитов может быть обусловлено их способностью усиливать сродство индуктора агрегации к рецепторам (синергисты) или каким-либо образом блокировать доступ лиганда к своему рецептору. Кроме того, возможным является агонистическое влияние на рецептор с малой константой ассоциации агониста с рецепторной молекулой.

Показано что, N -адамантоильное производное биогенного амина триптамина 4 проявляет свойства слабого синергиста, при введении карбоксильной группы эффект полностью пропадает для 1б, а замена индольного гетероцикла на имидазольный в N -(1-адамантоил)-D,L-гистидине 1а приводит к уменьшению агрегирующего эффекта серотонина на 38% (рис. 3 и табл. 3). Полученные результаты с добавлением исследуемых веществ при индукции агрегации тромбоцитов серотонином показали способность одного из соединений блокировать проведение сигнала через сопряженные с G-белками серотониновые рецепторы. Наиболее активное уменьшение серотонин-индуцируемой агрегации оказывает соединение 1а, в молекуле которого расстояние между атомом азота пиридина и атомом кислорода амидной группы соответствует 5,75 Å, оно примерно такое же, как в молекуле серотонина (табл. 3). Это согласуется и с теоретическим предсказанием возможной антисеротонинэргической активности у данного соединения и является еще одним обоснованием того, что уменьшение агрегации, вероятно, связано с конкурентным блокированием серотониновых рецепторов.

Таблица 3. Влияние производных адамантана на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№	Структура соединений	Интенсивность агрегации, усл.ед		Характер действия
		контроль	опыт
1а	O COOH N CH CH N H2 N H	34,2±3,8	20,8±0,7*	антагонист
1б	O COOH N CH CH H2 N H	27,8±1,9	24,3±1,0	не проявляет активности
4	O N CH CH H 22 N H	33,03,4	46,0±0,9*	слабый синергист

Примечание: * уровень достоверности Р<0,01

Таким образом, полученные экспериментальные данные подтверждают биологическую активность исследуемых соединений по отношению к тромбоцитам крови человека in vitro . Результаты наших исследований подтверждают известные литературные данные о том, что введение в молекулу производного высоколипофильного адамантильного радикала усиливает его взаимодействие с гидрофобными областями рецепторных молекул [1, 2], соединение 1б имеет подобную активность, препятствуя проведению сигнала активации серотонином.

Выводы: исследуемые производные адамантана оказывают различное действие на индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека, было найдено 2 соединения, проявляющих свойства антагониста и синергиста, при серотонин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека in vitro, что является следствием их способности влиять на функционирование тромбоцитарных рецепторов. Показано что наибольшая активность характерна для N-(1-адамантоил)-D,L-гистидина проявляющего свойства антагониста (увеличение на 38%). Эффект усиления агрегации в присутствии 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индола на 39% предположительно обусловлен способностью данного производного увеличивать эффективность функционирования гликопротеиновых рецепторов на поверхности тромбоцитов. Механизм влияния данных производных адамантана на серотонин-индуцированную аггрега-цию требует дальнейшего изучения.