The impact of passage through the intestine of the earthworm Aporrectodea caliginosa on the bacterial community

Почвенные животные и микроорганизмы влияют на плодородие почвы (Звягинцев и др. 2005). Это влияние часто реализуется через зоомикробные взаимодействия (Byzov at al., 1993; Bi at al., 2018). В частности, почвенные животные в ассоциации с микроорганизмами в почве проводят трансформацию (минерализацию и гумификацию) органических остатков, в том числе и биополимеров (Chang at al., 2016), мобилизацию–иммобилизацию элементов питания (Бызов, 2005). От содержания и качества гумуса значительно зависит плодородие (Hargitai,1993). Животные-сапрофаги измельчают, перемещают, перемешивают подстилку и переваривают ее совместно с кишечными микроорганизмами. В дальнейшем их экскременты трансформируются (“стареют”) под воздействием микробиологических, физических и химических процессов. В результате образуются гумусовые горизонты (Bal, 1970). Одним из востребованных и перспективных подходов к изучению вклада микробного комплекса в преобразования органических остатков в почве является оценка экофизиологических особенностей его членов: физиологического разнообразия, преобладающих физиологических состояний и экологических стратегий (Благодатская, 2004; Благодатская, 2008; Córdova, 2018). Подход основан на анализе кинетических характеристик микроорганизмов. Определение кинетики роста и построение моделей, описывающих его, востребовано в прикладных научных исследованиях, в медицинской и пищевой промышленности, оценке экологического состояния окружающей среды (Panikov, 2016; Stanbury at al., 2017; Atungulu at al., 2016; Dev at al., 2016). Проводятся исследования влияния на скорость роста микроорганизмов плотности биомассы (AlSayed at al., 2017; Krichen et al., 2018), кислотности среды (Akkermans, Van Impe, 2018) и др. Экологические стратегии, преобладающие среди кишечных микроорганизмов, и их физиологическое состояние позволяют понять механизмы трансформации органического вещества в пищеварительной системе животных и зоомикробных взаимодействий.

Дождевые черви – одни из наиболее значимых для плодородия почвенных животных (Huang, Xia, 2018; Peigné at al., 2018; Sanchez-Hernandez at al., 2018; Sanchez-Hernandez, 2018) . Им посвящено множество работ по физиологии (Laverack, 1963; Satchell, 1983) , экологии (Юрков и др., 2008; Тихонов и др., 2011; Кутовая, 2012; Храмченкова и др., 2012) и применению в сельском хозяйстве (вермикомпостирование) (Бызов, Якушев, 2008) .

Цель исследования – изучение транзитного (полостного) бактериального комплекса кишечника Aporrectodea caliginosa : сравнение в почве и копролитах разнообразия бактериального комплекса, преобладающих среди его членов экологических стратегии и физиологических состояний.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

В г. Москве на территории Ботанического сада МГУ им. М.В. Ломоносова на Воробьевых горах собрано 20 особей (15 ювенильных и 5 половозрелых) эврибионтных эндогейных дождевых червей Aporrectodea caliginosa , определенных по специализированной литературе (Всеволодова-Перель, 1997) . Черви содержались неделю в условиях лабораторного микрокосма при постоянной весовой влажности почвы 45% и температуре 25°C в образце (0.8 кг) гумусово-аккумулятивного горизонта техноурбанозема (Розанова и др., 2016) , в котором они обитали в природе. Для получения экскрементов червей отмывали от почвы, помещали в чашку Петри и выдерживали сутки при температуре +10°. Количество бактерий на поверхности червей несопоставимо меньше, чем в копролитах, и их влиянием можно пренебречь. После этого копролиты собирали и анализировали одновременно с образцами почвы (корма).

Экофизиологическую характеристику бактериальных комплексов проводили комплексным структурно-функциональным Таблица 1. Набор полимеров, использованных в селективных средах

Полимер Происхождение Доступность для разложения Хитин Животное и грибное Трудно Целлюлоза Растительное Трудно Пектин Растительное Средне Крахмал Растительное Средне Ксилан Растительное Средне Декстран 500 Бактериальное Средне Твин 20 Общее Легко Казеин Общее Легко методом (Якушев, 2015). Поскольку исследовался ключевой для разложения органических остатков гидролитических бактериальный блок, то в качестве источника углерода в селективных питательных средах использовали полимеры (табл. 1).

Метод не исследует микроорганизмы на классических для почвенной микробиологии уровнях изучения: операционных таксономических единицах, целых сообществах или биохимических процессах, проводимых микробным комплексом. Он изучает не исследованные ранее, временно возникающие в микролокусе из пула ассоциации (смешанные культуры), которые непосредственно осуществляют большинство процессов в природе. В комплексном методе эти консорции микроорганизмов воссоздаются посредством создания инициированных сообществ в лабораторных микрокосмах после внесения суспензии исследуемого природного сообщества в набор селективных жидких питательных сред. При этом анализируются возникающие кинетические параметры сукцессионных изменений. Поскольку процесс происходит в более контролируемых условиях, чем в классических почвенных инициированных сообществах, то его можно представить как рост и отмирание смешанной периодической культуры, описываемой классическими кинетическими параметрами: микробным экономическим коэффициентом, максимальной удельной скоростью роста, метаболическим коэффициентом и т.д. В данной работе исследовали инициированные бактериальные сообщества, содержащие аэробные и факультативно-анаэробные культивируемые микроорганизмы, использующие как трудно-, так и легкодоступные полимеры (филумы Cytophaga-Flavibacterium-Bacteroides, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria). В эти ассоциации входят не только гидролитические бактерии, но и их спутники, представленные как копиотро-фами, так и олиготрофами. Поведение инициированных гидролитических сообществ в лаг-фазе и фазе экспоненциального роста описывали уравнением комплексной модели периодической культуры (Якушев, 2015), которая для этих стадий роста идентична модели Н.С. Паникова (1991, 1996):

x(t) = X o (l - P₀ + р 0 е ^ ^т1), где х ( t ) – экспериментально установленная по оптической плотности концентрация клеток (кл./мл) в момент времени t (ч) в селективных жидких питательных средах; x 0 – экспериментально установленная концентрация клеток бактерий в момент инокуляции питательных сред почвенной суспензией (КОЕ/мл); μ m – максимальная удельная скорость ассоциации на среде с полимером (ч^-1); ρ 0 – начальное физиологическое состояние растущей смешанной культуры, характеризующее физиологическое состояние бактерий еще в почве – на момент инокуляции ими питательной среды. Чем ρ 0 выше, тем активность бактерий выше.

Биоразнообразие бактерий в инициированных гидролитических сообществах, сформировавшихся на жидких средах с полимерами, определяли по индексам Бергера–Паркера и Шеннона, рассчитанным по данным встречаемости морфотипов бактерий на чашках Петри на среде “Rich” (разбавленной глюкозо-пептоннодрожжевой среде). В результате получено по 7 индексов для инициированных сообществ из почвы и копролитов. Использование слабоселективной среды позволяет более полно учесть биоразнообразие инициированных гидролитических сообществ, чем высев на агаризованные варианты селективных сред, так как помимо гидролитических бактерий в данные сообщества входят копио-трофные и олиготрофные негидролитические бактерии, не способные вырасти на среде с полимерами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Распределения частот встречаемости значений индексов Шеннона и Бергера–Паркера инициированных гидролитических бактериальных сообществ (табл. 2) имеет ненормальный характер (рис. 1). Поэтому информативно применить непараметрический статистический анализ. Медианный и непараметрический дисперсионный анализы не выявили достоверных различий в биоразнообразии инициированных сообществ на средах с биополимерами, возникших из природных сообществ почвы и экскрементов.

Таблица 2. Морфотипы выделенных бактериальных сообществ

Среда	Корм		копролиты
	морфотип №	доля	морфотип №	доля
Крахмал	03	0.72	2	0.66
	04	0.26	4	0.30
	08	0.02	8	0.02
КМЦ	13	1	2	0.75
			9	0.25
Пектин	05	1	2	0.90
			100	0.08
			120	00.013
Ксилан	06	0.66	2	0.68
	11	0.3	4	0.06
			6	0.03
			8	0.20
Казеин	01	0.61	1	0.34
	0	0.38	2	0.13
			3	0.52
Твин 20	02	0.10	2	0.10
	08	0.21	3	0.45
	09	0.68	4	0.02
			8	0.37
			9	00.027
Декстран-500	02	0.86	2	00.091
	0	0.03	4	0.47
	07	0.38	6	0.11
	08	0.05	8	0.08
			100	0.24

A

Индекс Бергера-Паркера

В

Рис. 1. Ранговое распределение частот встречаемости индексов биоразнообразия инициированных гидролитических сообществ (А – индекс Бергера–Паркера, B – индекс Шеннона).

Поэтому был проведен непосредственный анализ ранговых распределений выявивший тенденцию к смещению в ходе пассажа доли встречающихся значений индекса Шеннона в сторону больших значений и меньших значений по индексу Бергера–Паркера. Увеличение биоразнообразия инициированных сообществ указывает на увеличение биоразнообразия бактериального комплекса копролитов: видовой состав становится более выровненным и разнообразным, а следовательно и более устойчивым. Возможно, слабые величины эффектов связаны с тем, что почва уже была сильно переработана червями. Семь дней для этого вполне достаточно. И по сути, анализировались старые копролиты, смешанные с почвой, и свежие копролиты, собранные в чашке Петри.

Максимальная удельная скорость роста (μ m ) и начальное физиологическое состояние гидролитических ассоциаций (ρ 0 ) распределены не нормально (рис. 2). Поскольку данные не подчиняются закону нормального распределения, то для сравнения использовались медианный и непараметрический дисперсионный анализы.

Непараметрический однофакторный дисперсионный анализ на основании критерия Краскела—Уоллиса (H (1, N = 80) = 13.9, p = 0.0002) и медианный тест по критерию согласия Пирсона (χ² = 13.3, df = 1, p = 0.0003) установили увеличение медианных значений ρ 0 для инициированных сообществ в ходе пассажа почвы через кишечник дождевого червя (рис. 3).

Эти анализы не выявили достоверных различий медианных значений μ m . Поэтому был проведен анализ ранговых распределений (рис. 4). При пассаже почвы через кишечник увеличивается доля быстрорастущих бактерий в бактериальном сообществе ко-пролитов (увеличивается доля класса со значениями μ m от 0.05 до 0.1 с 23 до 38% и уменьшается доля класса 0–0.05 с 46 до 34%).

максимальная удельная скорость роста

Рис. 2. Проверка на нормальность ранговых распределений (А – начальных физиологических состояний (безразмерная величина), B – максимальной удельной скорости роста (1/ч)) инициированных гидролитических сообществ.

Начальные физиологические состояния

Рис. 3. Начальные физиологические состояния (медиана и квартили) инициированных гидролитических сообществ, сформировавшихся на жидких средах с полимерами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При пассаже через кишечник дождевого червя транзитный почвенный бактериальный гидролитический комплекс становится более устойчивым, более выровненным и разнообразным. Происходит его активизация – начальное физиологическое состояние инициированных гидролитических сообществ выше. Среди его членов увеличивается доля быстрорастущих бактерий r -стратегов: на жидких средах с полимерами доля быстрорастущих инициированных гидролитических ассоциации повышается.

максимальная удельная скорость роста (почва)

максимальная удельная скорость роста (копролиты)

Рис. 4 Ранговые распределения частоты встречаемости максимальных удельных скоростей роста инициированных гидролитических бактериальных сообществ, сформировавшихся на средах с полимерами (A – почва, B – копролиты).