Влияние нано- и микрочастиц природных минералов на агрегацию тромбоцитов человека

Кристаллы минералов в природе содержатся во всех оболочках Земли и вступают во взаимодействие со всеми формами жизни, в том числе и человеком [1-5, 7-9]. Очевидно, что одной из важных характеристик при взаимодействии твердых минеральных частиц с живой материей, являются их размеры этих частиц.

Цель данного исследования: оценить влияния суспензий природных минералов (полевой шпат, α-кварц, вулканическое стекло, апатит), включающих фракции нано- и микро-размерных частиц, на агрегацию тромбоцитов человека in vitro.

Паничев Александр Михайлович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологии и охраны животных

Штарберг Михаил Анатольевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник центральной научно-исследовательской лаборатории

Гульков Александр Нефедович, доктор технических наук, профессор, директор Института нефти и газа Никифоров Павел Александрович, кандидат технических наук, старший преподаватель кафедры технологии металлов и металловедения

Братская Светлана Юрьевна, доктор химических наук, старший научный сотрудник лаборатории сорбционных процессов

Бородин Евгений Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии

Материалы и методы. В эксперименте исследовались следующие минералы: полевой шпат (Пш) (Приморский край), вулканическое стекло (Вс) (Богатырское месторождение, Приморский край), α-кварц (Ак) (район реки Большая Уссурка, Приморский край) и апатит (Ап) (Кольский полуостров). Минералы измельчались в планетарной мельнице Fritsch Pulverisette 4 во втором предустановленном режиме в течении 10 минут. Размерность частиц порошков определяли при помощи Fritsch Particle Sizer Analysette 22 (гранулометрический анализ кварца, полевого шпата, вулканического стекла и апатита приведены на рис. 1). Размеры подавляющего числа частиц лежали в диапазоне от 100 нм до 20 мкм (в случае полевого шпата – до 25 мкм). Два пика на всех графиках появляется из-за метода обработки: планетарная мельница сначала измельчает образец до некоторого среднего размера, а потом начинает молоть до наноразмеров. В нашем случае, 10 минут недостаточно для помола всех минералов, отличающихся по шкале твердости Мооса, до одной фракции. Стоит отметить, что измельчение минералов более 10 минут может привести к сдвигу кристаллической решетки.

Определение электрокинетического потенциала ( ζ -потенциал) минеральных частиц в электролите (0,9% раствор NaCl) проводили с использованием прибора Zeta Sizer Nano ZS (Malvern, Великобритания) при температуре 25ºC, фиксированном угле рассеяния 173º и длине волны лазера 633 нм. Анализ частиц проводился после 30-минутного отстаивания раствора.

а

в                                                           г

Рис. 1. Гранулометрические диаграммы: а) кварца, б) полевого шпата, в) вулканического стекла, г) апатита. (по оси абсцисс – размер в мкм, по оси ординат – доля частиц определенного размера)

Непосредственно перед исследованием из порошков готовили растворы минералов (0,1 г порошка на 10 мл физиологического раствора), в которых после энергичного непродолжительного встряхивания во взвешенное состояние переходило около ¾ части от общего объема порошка. Растворы отстаивали 10 минут, после чего верхнюю часть (не более 3 мл суспензии) аккуратно забирали для исследований. Полученные таким образом суспензии содержали наиболее тонкую фракцию частиц. При стоянии суспензии минералы продолжают медленно выпадать в осадок, поэтому перед внесением в плазму суспензии встряхивали.

Влияние суспензий минералов на агрегацию тромбоцитов исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов AP 2110 («Солар», Беларусь), совмещенного с ПЭВМ. В основе принципа работы агрегометра лежит метод светорассеяния (турбидиметрический метод), предложенный Борном [6]. Нами был использован блок светофильтров с маркировкой «А» (спектральный диапазон от 500 до 700 нм). Измерения проводили согласно инструкции к агрегометру, но с некоторыми изменениями.

Для получения бестромбоцитной и тромбоцитной плазмы кровь брали утром натощак пункцией иглой локтевой вены, самотеком, в пластиковые центрифужные пробирки. Донорами крови были 4 молодых (в возрасте от 25 до 33 лет) практически здоровых мужчин. Для предупреждения свертывания в пробирки предварительно вносили по 1 мл 3,8%-го раствора цитрата натрия (соотношение: 9 мл крови к 1 мл цитрата натрия). Для отделения тромбоцитной плазмы свежую цитратную кровь центрифугировали при 100g в течение 15 минут. Супернатант (тромбоцитная плазма: 330-360 тысяч тромбоцитов на мкл) перемещали в пластиковые пробирки. Оставшуюся кровь повторно центрифугировали при 2000 g в течение 15 минут. Надосадок (бестромбо-цитная плазма) отбирали в пластиковые пробирки. Стандартизацию плазмы проводили разведением тромбоцитной плазмы бестром-боцитной плазмой до содержания клеток от 200*109/л до 250*109/л. В стандартизированной тромбоцитной плазме (далее СТП) исследовали агрегацию тромбоцитов (контрольные и опытные пробы). Анализ плазмы проводили не позднее 3-х часов после забора крови.

В качестве индуктора агрегации использовали раствор динатриевой соли аденозин-5`-дифос-форной кислоты (НПО «Ренам», Россия; далее АДФ) в концентрации вызывающей необратимую агрегацию. Рабочий раствор АДФ №1 содержал 50 мкг АДФ (100 мкМ на 1 мл физиологического раствора). Рабочий раствор АДФ №2 содержал 100 мкг АДФ (200 мкМ на 1 мл физиологического раствора). СТП прогревали в термостате до 370С. В контрольные пробы вносили по 0,45 мл СТП и 0,1 мл рабочего раствора АДФ №1. В опытные пробы вносили по 0,45 мл СТП, 0,05 мл суспензии минерала (СТП и суспензии минералов не инкубировали) и 0,05 мл рабочего раствора АДФ №2. Таким образом, конечная концентрация АДФ в контроле и опыте составляла около 10 мкг (20 мкМ). При добавлении суспензий в плазму светопоглощение пробы возрастает пропорционально концентрации частиц, что вносит погрешность при сравнении показателей агрегации тромбоцитов в опытной и контрольной плазме. С целью устранения погрешности для контроля и суспензии конкретного минерала уровень 100%-го светопропускания устанавливается отдельно. Для контроля это бестром-боцитная плазма, для опыта – бестромбоцит-ная плазма с добавлением суспензии минерала, соответствующей концентрации. Статистическая обработка данных проводилась по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Установлено, что внесение в плазму исследуемых минералов в виде суспензий (10 мг/мл) не вызывает агрегацию тромбоцитов. Агрегация не наступала и при инкубировании (до 60 минут) суспензий с плазмой при 37⁰С. Результаты влияния минералов на АДФ-инициируемую необратимую агрегацию отображены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние суспензий минералов (10мг/мл) на агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Параметр	Максимальная агрегация, %	Время максимальной агрегации, сек	Скорость агрегации, %/30 сек
Контроль (1)	54,25±0,77 44,4±0,61 Р 1-2 ≤0,001	193±7,69 207,5±8,81 Р 1-2 ≤0,01	41,2±0,65 41,9±0,77 Р 1-2 >0,5
Пш     (2)
Контроль (3)	75,75±1,33 57,9±0,93 Р 3-4 ≤0,001	217,2±5,74 216,3±4,13 Р 3-4 >0,5	67,1±0,58 52,5±1,2 Р 3-4 ≤0,001
Ак      (4)
Контроль (5)	49,6±0,89 36,9±0,42 Р 5-6 ≤0,001	288±7,3 343,5±7 Р 5-6 ≤0,001	38,6±1,2 31,4±0,85 Р 5-6 ≤0,001
Вс       (6)
Контроль (7)	46,43±0,91 36,5±0,65 Р7-8≤0,001	265,6±5,61 265,8±6,43 Р 7-8 >0,5	44,7±0,52 36,5±0,77 Р7-8≤0,001
Ап      (8)

В ходе эксперимента было показано, что минеральные суспензии препятствуют агрегации тромбоцитов. Максимальный уровень агрегации по сравнению с контрольными значениями выражено снизился (приблизительно на 10-17% от контроля) в присутствие всех исследуемых минералов. При пересчете значений исследуемых показателей агрегации на абсолютные проценты видно, что суспензии минералов практически не уступают друг другу в снижении уровня агрегации тромбоцитов (рис. 1). Время достижения максимальной агрегации практически не изменялось при добавлении Пш, Ак и Ап, а при добавлении Вс увеличивалось. Третий показатель агрегабель-ности тромбоцитов, скорость агрегации, снижалась при внесении в плазму Ак, Вс, Ап и Пш не изменил данный показатель. Формы контрольных и опытных агрегатограмм практически не отличаются.

Рис. 2. Влияние суспензий минералов на уровень максимальной агрегации в %.

Можно предположить, что антиагрегационные свойства измельченных минералов могут быть связаны с их сорбционной способностью за счет пористости, а также электростатическими взаимодействиями с мембраной тромбоцитов. Результат определения электро-кинетического потенциала исследуемых минералов приводятся в табл. 2.

Таблица 2. Электрокинетический потенциал ( ζ -потенциал) минеральных частиц

Образец	ζ -потенциал, мВ
полевой шпат	-28 ± 5
α -кварц	-27 ± 2
вулканическое стекло	-36 ± 1
апатит	-7.1 ± 0.6

Вывод: ζ -потенциал минеральных частиц на агрегацию практически не влияет. Наиболее вероятными причинами подавления агрегации могут быть сорбция белков, АДФ, тромбоцитов.