Влияние неоадъювантной терапии на экспрессию молекулярных маркеров в ткани желудка

Белковый и энергетический обмен являются ключевыми механизмами, определяющими жизнеспособность клетки, в том числе и опухолевой, и связаны с 5'АМФ-ак- тивируемой протеинкиназой (AMPK) и серин/треониновой протеинкиназой mTOR [3,4]. Выявлены неоднозначные данные о роли AMPK в онкогенезе. Известно, что активация данной протеинкиназы может сопровождаться развитием противоопухолевого эффекта [5]. Также имеются сведения, что АМРК связана с развитием резистентности к химиотерапевтическому лечению при РЖ [6]. Роль киназы mTOR в онкогенезе разнообразна. Она интегрирует различные сигнальные пути, в том числе AKT/mTOR, которые активируются под влиянием ростовых факторов и митогенов [7].

В настоящее время имеются скудные сведения о маркерах, способных предсказывать эффект неоадъювантной терапии при РЖ. В частности, известно, что уровень экспрессии гена AKT может прогнозировать эффект химиотерапии при РЖ [10,11]. Полагают, что в этом участвует комплекс молекулярных показателей, например, компоненты AKT/mTOR сигнального каскада [12,13], формирующие чувствительность к лечению и непосредственно связанные с аутофагией [6].

Полагают, что изменение изучаемых молекулярных маркеров представляют собой наиболее универсальный подход для оценки эффективности терапии опухолей различного происхождения [13]. Известно, что эффект химиотерапии на основе 5-фторурацила и цисплатина связан с изменением экспрессионных профилей компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов и маркеров аутофагии [8, 14]. В целом влияние неоадъювантной терапии на экспрессию компонентов AKT/m-TOR сигнального пути и AMPK не изучена.

ЦЕЛЬ

Цель работы заключалась в исследовании экспрессии компонентов AKT/m-TOR сигнального пути и AMPK в ткани опухоли у больных РЖ на фоне химиотерапии по схеме FLOT.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Проведение данной работы одобрено этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ. Все процедуры с вовлечением больных были проведены в соответствии с Протоколом Хельсинской декларации по правам человека (1964 г.) Все больные подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК

РНК выделяли с помощью набора RNeasy mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany). Для оценки количества выделенной РНК на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделенной РНК. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280 = 1,95–2,05; А260/А230 = 1,90–2,31. Целостность РНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA). RIN составил 5,6–7,8.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Уровень экспрессии генов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе iCycler (Bio-Rad, USA). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора OT m-MuLV-RH (БиоЛабмикс, Россия) со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР ставили в трех репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (БиоЛабмикс, Россия), 300 нM прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК.

4E-BP1 : F 5'-CAGCCCTTTCTCCCTCACT-3',

R 5'-TTCCCAAGCACATCAACCT-3';

AKT1 : F 5'-CGAGGACGCCAAGGAGA-3',

R 5'-GTCATCTTGGTCAGGTGGTGT-3';

С-RAF : F 5'-TGGTGTGTCCTGCTCCCT-3',

R 5'-ACTGCCTGCTACCTTACTTCCT-3';

GSK3b : F 5'-AGACAAGGACGGCAGCAA-3',

R 5'-TGGAGTAGAAGAAATAACGCAAT-3';

70S kinase alpha : F 5'-CAGCACAGCAAATCCTCAGA-3', R 5'-ACACATCTCCCTCTCCACCTT-3';

m-TOR : F 5'-CCAAAGGCAACAAGCGAT-3', R 5'-TTCACCAAACCGTCTCCAA-3';

PDK1 : F 5'-TCACCAGGACAGCCAATACA-3',

R 5'-CTCCTCGGTCACTCATCTTCA-3';

VHL: F 5'-GGCAGGCGAATCTCTTGA-3',

R 5'-CTATTTCCTTTACTCAGCACCATT-3'

AMPK : F 5'- AAGATGTCCATTGGATGCACT-3',

R 5'-TGAGGTGTTGAGGAACCAGAT-3';

GAPDH : F 5'-GGAAGTCAGGTGGAGCGA-3', R 5'-GCAACAATATCCACTTTACCAGA-3'.

Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл — 94 °С, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов — 1 шаг 94 °С, 10 сек и 2 шаг 20 сек — при температуре 60°С. Праймеры были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI nih. gov/nuccore).

В качестве референсного гена использовали ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase), уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии GAPDH. Количественный анализ экспрессии проводили по 2∆∆Сt по отношению к конститутивно-экспрессируемому гену-рефери фермента GAPDH.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 8.0. Проверку нормальности проводили с помощью с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Результаты определения экспрессии генов представлены как Me (Q1; Q3). Значимость различий оценивали по критерию Манна–Уитни, при исследовании более 2 групп использовали непараметрический дисперсионный анализ (Kruskal–Wallis test, Median Test). Различия считали значимыми при р < 0,05. Корреляционный анализ проводился с помощью непараметрического критерия Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ранее проведенных исследованиях отмечены изменения экспрессии AKT/mTOR сигнального каскада, связанные с распространенностью РЖ. Отмечено увеличение экспрессии всех компонентов данного каскада, за исключением mTOR и AKT, которые снижались на фоне роста фосфатазы PTEN [9].

При исследовании уровня показателей после проведенной неоадъювантной терапии выявлено снижение экспрессии 4EBP1 в 2,2 раза в ткани опухоли.

Отмечены ассоциации между молекулярными параметрами в опухоли, характеризующие биологическое поведение опухоли. Так, выявлены многочисленные корреляции между киназой AMPK, PTEN (r = 0,39; p < 0,05), mTOR (r= 0,37, p < 0,05), 70S 6 киназой (r= 0,54; p < 0,05). При этом экспрессия киназы c-RAF имела ассоциацию с PDK (r= 0,50; p < 0,05), а 70S 6 киназа имела отрицательную ассоциацию с AKT (r =–0,37; p < 0,05).

Показатель, Усл. ЕД.	До лечения	После лечения
PDK	1,54 (0,35; 6,89)	1,25 (0,06; 9,49)
AKT	0,99 (0,21; 2,21)	1,95 (1,58; 76,00)
c-RAF	6,77 (1,27; 29,60)	15,07 (6,57; 120,76)
GSK-3β	1,95 (0,30; 16,84)	1,12 (0,02; 2,29)
PTEN	2,13 (0,20; 9,78)	7,18 (0,00; 29,82)
mTOR	0,99 (0,19; 1,62)	4,74 (0,15; 6,83)
4EBP1	3,1 (0,45; 56,87)	1,41 (0,48; 15,62) *
70s 6 киназа	3,92 (0,54; 15,40)	8,02 (0,26; 32,66)
АМРК	1,45 (0,11; 7,95)	11,10 (0,07; 65,38)

Примечание: * — значимость различий по сравнению с показателем до лечения, p < 0,05;

При исследовании изучаемых показателей в зависимости от эффекта лечения отмечено изменение экспрессии 4EBP, mTOR, AMPK по мере уменьшения эффекта терапии в группах пациентов с полной регрессией, частичной регрессией, стабилизацией и прогрессированием заболевания (табл. 2). Наиболее высокий уровень мРНК показателей представлен у пациентов с полной регрессией.

ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении корреляционного анализа были выявлены ассоциации между изучаемыми молекулярными маркерами, свидетельствующие о влиянии АМРК на состояние основных компонентов изучаемого внутриклеточного каскада. Известно, что активация AMPK может сопровождаться фосфорилированием mTOR, p70S6K и 4E-BP1, способствуя снижению интенсивности основных процессов онкогенеза в культуре клеток РЖ [5]. Также выявлено, что развитие резистентности при РЖ связано с активацией АМРК и ингибированием компонентов АKT/ mTOR сигнального каскада [6,14].

В настоящее имеются единичные неоднозначные сведения о связи молекулярных маркеров с эффектом неоадъювантной терапии. Полагают, что резистентность к лечению связана с развитием аутофагии, что происходит с участием основных компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов [3]. В проведенном исследовании выявлено, что экспрессия 4EBP1, AMPK и mTOR связана с эффективностью проведенной химиотерапии. Показано, что изначально высокие уровни экспрессии 4EBP, mTOR, AMPK ассоциированы с регрессией опухоли и ее чувствительностью к неоадъювантной терапии. Вероятно, это объясняется их ролью в формировании биологического поведения опухоли, что подтверждается ранее представленными данными [5,6].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неоадъювантная терапия при РЖ влияет на уровень экспрессии гена 4EBP1 в опухоли. Выявлены молекулярные маркеры, ассоциированные с эффектом лечения и развитием резистентности. Высокая экспрессия AMPK, mTOR и 4EBP1 в опухоли до начала лечения опосредует эффект при комбинированной терапии РЖ и связана с регрессией опухоли.

Показатель, Усл. ЕД.	Полная регрессия	Частичная регрессия	Стабилизация	Прогрессирование
PDK	0,07 (0,06; 0,09)	0,86 (0,01; 5,17)	3,15 (0,30; 7,11)	14,18 (1,64; 25,72)
	Kruskal–Wallis test: p > 0,05; Median Test: p > 0,05
AKT	0,10 (0,10; 0,15)	0,99 (0,61; 1,06)	0,89 (0,03; 38,59)	0,74 (0,07; 1,42)
	Kruskal–Wallis test: p > 0,05; Median Test: p > 0,05
c-RAF	17,25 (15,5; 17,8)	6,77 (1,27; 32,20)	16,32 (0,05; 133,77)	2,70 (0,69; 4,72)
	Kruskal–Wallis test: p > 0,05; Median Test: p > 0,05
GSK-3β	18,20 (18,30; 18,6)	1,95 (0,14; 2,19)	10,54 (0,72; 36,43)	0,64 (0,16; 1,13)
PTEN	5,56 (5,57; 5,80)	8,28 (0,20; 8,52)	2,20 (0,04; 9,78)	22,57 (1,44; 43,71)
	Kruskal–Wallis test: p > 0,05; Median Test: p > 0,05
mTOR	12,2 (12,30; 12,50)	0,99 (0,64; 5,70)	0,24 (0,19; 1,60)	0,75 (0,22; 1,28)
	Kruskal–Wallis test: p < 0,05; Median Test: p < 0,05
4EBP1	400,00 (200,00; 450,00)	1,24 (0,42; 4,56)	1,88 (0,45; 56,89)	76,9 (0,52; 153,28)
	Kruskal–Wallis test: p < 0,05; Median Test: p < 0,05
70s 6 киназа	6,90 (6,5; 6,8)	3,92 (0,54; 4,06)	3,54 (0,02;15,40)	51,88 (43,41; 60,35)
	Kruskal–Wallis test: p > 0,05; Median Test: p > 0,05
АМРК	11,45 (10,45; 14,50)	1,45 (0,11; 9,25)	1,30 (0,01; 4,06)	5,36 (2,77; 7,95)
	Kruskal–Wallis test: p < 0,05; Median Test: p < 0,05