Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм на уровень активных форм кислорода и систему ПОЛ - АОЗ в культурах клеток CHO-K1 и A875

Введение. Меланома является самым агрессивным типом рака кожи. Показатель заболеваемости в мире растет ежегодно на 2-7 % [1]. Распространенность заболевания в России в течение 2015–2019 гг. возросла с 56,9 до 66,9 на 100 тыс. населения [2].

Медиана выживаемости пациентов с меланомой составляет всего 6-9 мес., а 5-летняя выживаемость - менее 5 % [3].

Существующие на сегодняшний день способы лечения меланомы кожи требуют высо- котехнологичного подхода, а результаты лечения остаются сложно предсказуемыми. Это обстоятельство делает необходимым поиск новых методов системного и местного лечения. В настоящее время появляются экспериментальные исследования по использованию фотобиомодуляции в терапии меланомы [4, 5].

При поиске эффективных параметров лазерного излучения для терапии меланомы кожи важным аспектом является глубина воздействия, позволяющая максимально затронуть новообразование. Среди спектров оптического излучения инфракрасный обладает максимальной глубиной проникновения [6]. В свою очередь внутриклеточным процессом, ассоциированным с данным диапазоном, является развитие окислительного стресса через продукцию супероксида [7, 8]. Клеточные механизмы, лежащие в основе клеточного адаптивного и/или активирующего окислительного стресса, вызываемого низкоуровневой световой или фото-биомодуляционной терапией, все еще остаются неясными для ближнего инфракрасного спектра (NIR) (750–3000 Нм), особенно для диапазона 1265–1270 Нм (самое высокое поглощение молекулярным кислородом) [9, 10].

Цель исследования. Изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм на уровень оксидатив-ного стресса и состояние системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в клетках эпителия яичника китайского хомячка и меланомы человека.

Материалы и методы. Для работы были выбраны две культуры клеток эпителиального происхождения: нераковая линия эпителия яичника китайского хомячка CHO-K1 (ATCC^® CCL-61™) и линия клеток меланомы человека A-875 (RRID:CVCL_4733).

Клетки культивировали в инкубаторе Sanyo MCO-18AIC (Япония) при влажности 100 %, температуре 37 °C и концентрации CO 2 5 %. До и во время проведения эксперимента клетки содержали в культуральной среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Biosera, Франция) и гентамицина в концентрации 50 мг/л («ПанЭко», Россия).

За 24 ч до эксперимента клетки сеяли в 8-луночные слайд-флаконы (SPL Lifesciences, Южная Корея) в концентрации 105 на ячейку. После прикрепления подвергали воздействию инфракрасного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм.

Использовали следующие источники и параметры излучения:

• 1.    Перестраиваемый узкополосный лазер Yenista Optics Osics T100 (Франция): длина волны – 1265 нм, мощность – 4,2 мВт, время облучения 30/60 мин, плотность энергии 9,45/18,9 Дж/см².

• 2.    Лазерный диод LD-1265.5-FBG-350 (Innolume, Германия): длина волны 1265 нм, мощность 10/100 мВт, время облучения 30 мин, плотность энергии 22,5/225 Дж/см². Плотность энергии (E, Дж/см²) лазерного излучения рассчитывали по формуле E=Pt/S, где P – средняя выходная мощность, Вт; t – время облучения, с; S – площадь облучения, см².

Облучение проводили в камере настольного инкубатора UNO H501-T (Okolab, Италия) в условиях, идентичных условиям культивирования. В то время как одну из ячеек слайд-флакона подвергали облучению, другая (контрольная) была закрыта металлической фольгой для защиты от излучения. Все эксперименты проводили не менее чем в трех повторах.

С помощью флуоресцентной микроскопии определяли концентрацию активных форм кислорода, используя краситель 2’,7’-дихлор-офлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA, Sigma-Aldrich, США), как описано ранее [11].

Результат окрашивания оценивали с использованием инвертированного микроскопа Nikon Ti-S, дополненного фотокамерой DS-Qi1MC, объективом Nikon S Plan Fluor ELWD 20×0.45 с соответствующими фильтрами и ПК с программой Nikon NIS-elements 4.0.

Обработку изображений проводили в компьютерной программе ImageJ (Национальный институт здоровья, США). Скорректированную интегральную флуоресценцию клетки (СИФК) рассчитывали по формуле СИФК = интегральная плотность – (площадь выделенной клетки × фоновое значение флуоресценции) [12].

Для определения состояния системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) после облучения клетки снимали с использованием 0,25 % раствора трипсин-ЭДТА («ПанЭко», Россия), ре-суспендировали в натрий-фосфатном буфере (pH 7,4) и подсчитывали количество клеток в каждом образце в камере Горяева. Далее натрий-фосфатный буфер удаляли центрифугированием, а клетки замораживали при -20 °C. Анализ продуктов ПОЛ и активности ферментов-антиоксидантов проводили в лизате клеток.

В клетках меланомы определяли уровень продуктов ПОЛ: диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов (КД), оснований Шиффа (ОШ), малонового диальдегида (МДА), а также активность ферментативного звена антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глута-тионредуктазы (ГР) и восстановленного глутатиона (GSH). Уровень ДК, КД и ОШ определяли спектрофотометрически по методике И.А. Волчегорского [13]. Содержание этих продуктов рассчитывали по отношению оптических плотностей гептановой фазы Е232/220 (ДК), Е278/220 (КД), Е400/Е220 (ОШ). Уровень МДА (мкмоль/л) определяли в тесте с ти-обарбитуровой кислотой по методу Л.И. Андреевой и соавт. [14]; активность каталазы и уровень GSH – по методу А.И. Карпищенко [15]; активность ГР – по методу В.С. Асатиани [16]. Активность СОД оценивали по способности конкурировать с нитросиним тетразо-лием (НСТ) за супероксидный анион по методу M. Nishikimi [17].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Stata v. 6.0. Достоверность различий между количественными показателями вычисляли, используя непараметрический U-критерий Манна–Уитни (p<0,05).

Результаты

Оксидативный стресс. При облучении клеток CHO-K1 лазерным излучением с плотностью энергии 9,45 Дж/см² достоверно увеличилась концентрация АФК по сравнению с контролем (в 1,47 раза). В клетках меланомы человека A875 изменений в концентрации АФК не произошло (рис. 1).

При увеличении плотности энергии облучения до 22,5 Дж/см2 в клетках линии CHO-K1 также наблюдалось достоверное повышение концентрации АФК (в 1,48 раза), при этом изменений в культуре клеток меланомы человека при плотностях энергии 22,5 и 225 Дж/см2 не отмечалось.

Рис. 1. Внутриклеточная концентрация активных форм кислорода в культурах клеток эпителия яичника китайского хомячка CHO-K1 и меланомы человека A875 при воздействии лазерного излучения с длиной волны 1265 нм и плотностью энергии 9,45, 22,5 и 225 Дж/см², отношение значения скорректированной интегральной флуоресценции (СИФК) эксперимента к контролю.

* – достоверное отличие между экспериментом и контролем (p<0,05)

Fig. 1. Intracellular concentration of reactive oxygen species in the Chinese hamster ovary epithelial cell line CHO-K1 and human melanoma A875 under laser therapy (1265 nm, energy density 9.45, 22.5 and 225 J/cm²), corrected total cell fluorescence (CTCF) – fold change compared to control.

* – the difference between experimental and control groups is statistically significant (p<0.05)

Система ПОЛ – АОЗ. Нами установлено, что непрерывное лазерное облучение на длине волны 1265 нм, мощностью 4,2 мВт и плотностью энергии 9,45 Дж/см² достоверно изменило (относительно контроля) содержание вторичного продукта ПОЛ – малонового диальдегида – в клетках меланомы и клетках эпителия яичника CHO-K1 (табл. 1). В клет-

ках меланомы произошел достоверный рост уровня МДА – в 1,9 раза, в клетках линии CHO-K1 уровень МДА снизился в 2 раза. Уровень продуктов перекисного окисления: диеновых конъюгатов, кетодиенов и оснований Шиффа – ни в одной из исследуемых клеточных линий достоверно не изменился.

Таблица 1

Table 1

Показатели системы ПОЛ – АОЗ в культурах клеток меланомы A875 (E=18,9 Дж/см2) и эпителия яичника китайского хомячка CHO-К1 (E=9,45 Дж/см2)

Indicators of AOD system and LPO products in A875 human melanoma cells (E=18.9 J/cm2) and Chinese hamster ovary epithelial cells CHO-K1 (E=9.45 J/cm2)

Анализ активности ферментов АОЗ в клеточных линиях показал, что уровень активности СОД в клетках CHO-K1 достоверно снизился более чем в 6 раз относительно контроля, а в клетках меланомы не изменился.

Активность каталазы под влиянием лазерного излучения достоверно возросла в клетках меланомы, однако в эпителиальных клетках

линии CHO-K1 произошло ее достоверное снижение.

Под влиянием лазерного излучения с плотностью энергии 9,45 Дж/см2 не произошло значимых изменений в системе глутатиона ни в одной из исследуемых клеточных линий. Уровень глутатиона и активность ферментов, осуществляющих обратимое превра-

Показатель Parameter	Клеточная линия A875 A875 cell line		Клеточная линия CHO-К1 CHO-K1 cell line
	Контроль Control	Опыт Experiment	Контроль Control	Опыт Experiment
МДА, мкмоль/л Malondialdehyde, µmol/L	14,15±1,53	27,32±1,7*	11,81±1,4	5,86±0,3*
ДК, ед. опт. пл./мл Diene conjugates, opt. density units/ml	1,74±0,18	1,61±0,11	0,49±0,01	0,52±0,1
КД, ед. опт. пл./мл Ketodienes, opt. density units/ml	0,18±0,005	0,19±0,002	0,04±0,01	0,05±0,01
ОШ, ед. опт. пл./мл Schiff base, opt. density units/ml	0,019±0,02	0,018±0,1	0,002±0,0005	0,003±0,001
СОД, усл. ед./л Superoxide dismutase, standard units/L	1,405±0,41	1,804±0,86	2,94±0,32	0,46±0,15*
Каталаза, ммоль/мин/л Catalase, mmol/min/L	66,97±9,94	151,68±15,78*	15,61±5,22	7,11±1,77*
ГПО, ммоль/мин/л Glutathione peroxidase, mmol/min/L	116±28,97	135,10±20,48	35,76±5,78	30,79±2,86
Глутатион, мкмоль/л Glutathione, µmol/L	0,644±0,077	0,687±0,057	0,149±0,03	0,184±0,023

Примечание. * – достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05).

Note. * – the differences are significant compared with the control group (p<0.05).

щение восстановленного глутатиона в окисленный, – глутатионпероксидазы и глутатион-редуктазы – не изменились.

Обсуждение. Увеличение концентрации активных форм кислорода и развитие окислительного стресса в ответ на воздействие лазерного излучения в диапазоне 1265–1270 нм было показано для фотобиомодуляции в разных дозах как на нормальных, так и на раковых клетках [9, 11, 18–20]. При этом наблюдались изменение мембранного потенциала митохондрий, окисление белков и ДНК, клеточная гибель и некоторые другие клеточные события. Подобная реакция клеток на облучение предположительно обусловлена вмешательством в работу митохондрий, считающихся основными акцепторами лазерного излучения в силу своей структуры и функции [21–25].

Облучение культуры меланомы человека A875 показало специфическую стойкость клеток к лазерному излучению в дозе от 9,45 до 225 Дж/см2, что выражалось в отсутствии развития оксидативного стресса (рис. 1). Данный диапазон плотностей энергии излучения относится к низким и средневысоким, при которых показано разнонаправленное воздействие на пролиферацию меланомы в зависимости от дозы, интенсивности и кратности воздействия [26, 27]. Стоит отметить, что концентрация активных форм кислорода при воздействии лазерного излучения 1265 нм увеличивалась в нормальных и раковых клетках как в данной работе, так и в предыдущих исследованиях [11, 19].

В связи с этим возникает вопрос, является ли подобный эффект особенностью изученной клеточной линии, особенностями меланом в целом или обусловливается намного раньше и является отличительной особенностью клеток, контактировавших в своем онтогенезе с внешней средой и различными видами оптических излучений.

В целом можно говорить о том, что в нераковых клетках CHO-К1 свободнорадикальные процессы были репрессированы. Это подтверждалось снижением содержания МДА, происходящим на фоне нарушения в работе каскада антиокислительных ферментов [28].

Наши результаты согласуются с данными, полученными К. Khorsandi et al. [29], которые наблюдали повышение уровня МДА в клетках меланомы линии А375 под влиянием низкоуровневого лазерного облучения с энергией 3 Дж/см2. Исследователи также отметили снижение активности глутатионпероксидазы в клетках A375 при облучении низкоуровневым лазерным излучением. В нашем эксперименте уровень активности данного фермента не изменился.

Заключение. Лазерное излучение с длиной волны 1265 нм и плотностью энергии 9,45–225 Дж/см² вызывает увеличение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода в клетках CHO-K1 и не оказывает влияния на клетки меланомы человека A875. При оценке состояния системы ПОЛ – АОЗ установлено снижение активности суперок-сиддисмутазы и каталазы, а также снижение концентрации малонового диальдегида в клетках CHO-K1 под влиянием лазерного излучения 1265 нм с плотностью энергии 9,45 Дж/см². В клетках A875 наблюдалось повышение активности каталазы и уровня малонового диальдегида при облучении с плотностью энергии 18,9 Дж/см² по сравнению с необлученным контролем. Прочие компоненты системы антиоксидантной защиты (глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, глутатион) и уровень продуктов ПОЛ (кетодиены, диеновые конъюгаты, основания Шиффа) в исследованных клеточных линиях воздействием лазерного излучения затронуты не были.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 19-415-730003 р_а).