Влияние низкой температуры на содержание белка и активность пероксидазы при инокуляции гороха Rhizobium leguminosarum

Автор: Акимова Г.П., Соколова М.Г.

Журнал: Журнал стресс-физиологии и биохимии @jspb

Статья в выпуске: 4 т.6, 2010 года.

Бесплатный доступ

Изучали изменение в содержании белка и активности пероксидазы в корнях гороха при воздействии инфицирования Rhizobium leguminosarum и низкой температуры. Показано, что количество белка и активность пероксидазы меняются в процессе взаимодействия с клубеньковыми бактериями и зависят от температуры и восприимчивости зон корня к ризобиям. Сделан вывод, что изменения в содержании растворимого белка и активности пероксидазы свидетельствуют об адаптационных изменениях в проростках гороха, что способствует нормальному ходу метаболических процессов и обеспечивает регуляцию взаимодействия растений с Rhizobium при гипотермии.

Активность пероксидазы, бобово-ризобиальный симбиоз, гипотермия, растворимый белок

Короткий адрес: https://sciup.org/14323504

IDR: 14323504

Текст научной статьи Влияние низкой температуры на содержание белка и активность пероксидазы при инокуляции гороха Rhizobium leguminosarum

Взаимоотношения бобового растения с клубеньковыми бактериями рода Rhizobium представляют собой сложный многоэтапный процесс, в результате которого происходят глубокие физиологические перестройки симбионтов (Spaink, 1995). Инфицирование корней бобовых растений Rhizobium сопровождается изменением экспрессии множества растительных генов на уровне синтеза белков. Во-первых, образуются новые специфические белки растительного происхождения – нодулины, необходимые для образования бобово-ризобиального симбиоза (Scheres et al., 1990; Cook et al., 1995; Хадри,

Бисселинг, 2002), во-вторых, вероятно, как и при инфицировании патогенами (Тарчевский, 1994), в клетках растений происходит репрограммирование экспрессии генов, проявляющееся в замедлении синтеза одних белков и усилении образования или появлении других, отсутствующих у неинокулированных растений.

Наиболее известными генами ранних нодулинов являются enod5, enod12, enod40, ген пероксидазы rip1 (Peng et al., 1996, Хадри, Бисселинг, 2002). Функции ранних нодулинов связывают, как с формированием структуры клубенька, так и с действием защитных механизмов растения-хозяина (Тихонович, Проворов, 1998).

Пероксидаза (ПО) – один из наиболее распространенных ферментов растений, который составляет 15% всех внутриклеточных белков. Будучи по своей природе полифункциональным, этот белок участвует во многих процессах жизнедеятельности растений, в том числе одним из первых откликается на стрессовые воздействия (Савич, 1989; Газарян,1992). Среди физиолого-биохимических факторов защиты растений от патогенных организмов ПО рассматривают как одну из важнейших каталитических систем, активно участвующих в авторегуляции метаболизма растений при заражении (Карташева и др., 2000). Взаимодействие патогена и хозяина вызывает значительное повышение активности ПО (Савич, 1989; Граскова и др., 2004). Роль ПО при симбиозе изучена слабо.

В работах Жизневской с соавторами показано, что при формировании симбиотической системы в цитозоле клеток эффективных клубеньков люпина блокируется синтез ряда белков и синтезируются новые белки – нодулины, а пероксидазная реакция рассматривается как ответ на внедрение активных ризобий в клетку растения-хозяина (Жизневская и др., 2001).

Наши результаты, полученные ранее, свидетельствуют о том, что ПО участвует во взаимодействии бобовых растений с Rhizobium и активность ПО имеет разную направленность изменений в участках корня, отличающихся по восприимчивости к ризобиальной инфекции (Акимова и др., 2002).

Низкие температуры вызывают значительные изменения в функциональном состоянии растений, что, прежде всего, связано с синтезом стрессовых белков (Войников и др., 2004) и уровнем пероксидазной активности (Савич, 1989; Минибаева, Гордон, 2003; Гималов, 2004). Однако эти вопросы, в связи с развитием симбиотических отношений в условиях действия низкотемпературного фактора остаются не изученными.

Цель работы: изучить влияние низкой положительной температуры и инокуляции Rh. leguminosarum на содержание растворимого белка и активность ПО в корнях проростков гороха.

МЕТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили растения гороха ( Pisum sativum L. ) сорта Марат. Исходные проростки выращивали в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водой, в термостате при разных условиях. Вариант I – исходные проростки выращивали при температуре 22 ⁰С в течение 2-х сут, затем инокулировали и подвергали воздействию

температуры 8 ⁰С. В варианте II – исходные проростки выращивали 7 сут при температуре 8 ⁰С, затем инокулировали. В варианте III – инокулировали семена, затем их проращивали до размера исходных проростков (7 сут 8 ⁰С) и далее на холоде. В качестве контроля использовали проростки, выращенные в течение 24 ч при 22 ⁰С (исх 2 сут 22 ⁰С) без инокуляции. Инокуляцию проводили водной суспензией 3-х суточной культуры клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv.viceae эффективного штамма 250а (CIAM 1026), полученного из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург, Пушкин). Во всех вариантах опыта исходные и опытные проростки выравнивали по физиологическому возрасту. Критерием однородности исходного растительного материала служила длина корня 25-30 мм.

Для исследования брали участки корня, отличающиеся по восприимчивости к

Rhizobium: 0-20 мм от кончика корня -восприимчивый и 20-40 мм - не восприимчивый.

Выделение растворимого белка проводили Na-фосфатным буфером рН 7,0. Содержание белка определяли с амидо-черным (Бузун и др., 1982).

Активность ПО определяли по начальной скорости окисления о-дианизидина перекисью водорода (Лебедева и др., 1977; Рогожин и др., 2001). Реакцию инициировали введением 0,1 мл 16 мМ Н 2 О 2 . Окисление о-дианизидина регистрировали по увеличению поглощения при 460 нм ( ε =30 мМ^-1см^-1). За единицу активности фермента принимали количество о-дианизидина (мкмоль), окисленного за 1 мин на 1 г сырого вещества.

Эксперименты проводили в трехшестикратной повторности. Полученные результаты обработаны статистически. В таблицах приведены средние арифметические величины и стандартные ошибки.

Таблица 1. Содержание растворимого белка в корнях проростков гороха через 24 ч инокуляции при температуре 22 0С (мг/г сырого вещества)

Зона корня, мм	Растворимый белок
Зона корня, мм	Контроль, Н 2 О	Инокуляция
0-20	19,0±1,1	17,0±1,0
20-40	12,5±0,8	12,6±0,7

Таблица 2. Содержание белка в корнях проростков гороха при влиянии инокуляции и гипотермии (вариант I) (мг/г сырого вещества).

Исходные проростки	Зона корня, мм	Время воздействия температуры 8 ⁰С
		1сут		2сут		3сут		5сут
		Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.
2 сут 22⁰С, Н 2 О	0-20	20,3±1,5	17,8±1,1	28,8±2,1	23,2±1,7	23,5±1,9	21,4±1,3	18,8±1,1	15,7±1,0
2 сут 22⁰С, Н 2 О	20-40	13,3±1,0	14,1±1,0	18,8±1,1	16,6±1,1	15,4±0,9	14,8±1,0	12,2±0,5	12,5±0,6

Таблица 3. Влияние температуры 8 0С на содержание белка в корнях проростков гороха, инокулированных на стадии прорастания (вариант II) и набухания (вариант III) семян (мг/г сырого вещества)

Вариант	Зона корня, мм	Контроль, Н 2 О			Инокуляция
		Время воздействия температуры 8 ⁰С, сут
		7с	8с	10с	7с	8с	10с
II	0-20	29,1±1,9	35,4±2,8	40,7±2,9	26,8±1,9	32,8±2,7	37,7±2,8
II	20-40	9,8±0,3	9,5±0,5	9,7±0,6	10,0±0,7	9,7±0,7	10,2±0,8
III	0-20	29,1±1,9	35,4±2,8	40,7±2,9	27,0±2,2	30,8±2,5	34,7±1,9
III	20-40	9,8±0,3	9,5±0,5	9,7±0,6	10,0±0,7	10,6±0,8	11,0±0,9

Таблица 4. Активность пероксидазы корней гороха при влиянии инокуляции в оптимальных условиях роста (мкМ /г сырого вещества)

Исходные проростки	Зона корня, мм	Время воздействия температуры 24 ч 22⁰С
		Контроль, Н 2 О	Инокуляция
2 сут 22⁰С Н 2 О	0-20	5,3±0,1	4,0±0,1
	20-40	5,5±0,1	6,2±0,2

Таблица 5. Активность пероксидазы корней гороха при влиянии инокуляции и гипотермии (вариант I) (мкМ / г сырого вещества)

Исходные проростки	Зона корня, мм	Время воздействия температуры 8⁰С
		1 сут		3 сут		5 сут		7 сут		8 сут
		Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.
2 сут 22⁰С Н 2 О	0-20	7,9±0,3	5,8±0,2	8,1±0,5	6,5±0,3	6,1±0,3	5,2±0,2	6,0±0,3	4,6±0,2	5,7±0,2	6,3±0,2
2 сут 22⁰С Н 2 О	20-40	-	-	8,0±0,3	6,9±0,2	6,4±0,2	5,5±0,1	5,7±0,2	6,4±0,2	5,8±0,2	6,5±0,3

Таблица 6. Активность пероксидазы корней гороха при влиянии инокуляции и гипотермии (вариант II) (мкМ / г сырого вещества)

Исходные проростки	Зона корня, мм	Время воздействия температуры 8⁰С
		1 сут		3 сут		5 сут		7 сут
		Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.	Н 2 О	Инок.
7 cут 8⁰C	0-20	4,8±0,1	3,2±0,1	4,6±0,2	3,8±0,1	4,3±0,2	5,0±0,2	4,3±0,1	5,4±0,2
Н 2 О	20-40	5,0±0,2	6,2±0,3	5,5±0,2	6,0±0,3	4,7±0,1	6,0±0,2	4,7±0,2	4,7±0,1

Таблица 7. Активность пероксидазы корней гороха при влиянии инокуляции и гипотермии с момента прорастания семян (вариант III) (мкМ / г сырого вещества)

Исходные проростки Зона корня, мм Время воздействия температуры 80С 1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 8 сут Н2О Инок. Н2О Инок. Н2О Инок. Н2О Инок. Н2О Инок. 7 cут 80C Н2О 0-20 - 2,6±0,1 - 4,7±0,2 - 4,8±0,2 - 5,9±0,2 - 3,8±0,1 20-40 - - - 5,8±0,2 - 4,9±0,2 - 6,0±0,3 - 4,5±0,1 проростки, как показано нами ранее, резко

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как показано в таблице 1 при инфицировании проростков гороха в оптимальных температурных условиях роста содержание растворимого белка снижается в восприимчивом к ризобиальной инфекции участке (0-20 мм) и не изменяется в более зрелом, не восприимчивом участке корня (20-40 мм).

Таким образом, инокуляция оказывает влияние на содержание белка в корнях проростков гороха. При этом в восприимчивых к инфекции участках корня наблюдается тенденция к снижению содержания белка.

Показано, что локализация инфекционных сайтов (восприимчивый к инфекции участок корня) соответствует месту пролиферации дедифференцированных клеток внутренней коры корня, ведущих к образованию примордиев клубенька (Verma, 1992; Соколова, 2001) . Вероятно, интенсивное деление этих клеток можно рассматривать как одну из причин снижения содержания белка в зоне наибольшего проникновения бактерий (Обручева, 1982).

Как известно низкая положительная температура существенно влияет на рост растений. При действии температуры 8 0С на снижаются скорость деления и растяжение клеток, замедляются темпы роста и внедрения ризобий (Акимова и др., 1999, 2002).

Содержание белка в корнях проростков (I) при резком снижении температуры с 22 до 8 0С первые двое суток воздействия гипотермии возрастает, затем к 5 суткам сравнивается с контрольным уровнем на тепле (табл.1, 2). При этом у инокулированных растений содержание белка ниже, чем у неинокулированных.

При действии температуры 8 0С с момента прорастания семян (II и III) проростки, вероятно, более адаптированы к условиям низкой температуры, содержание белка в корнях выше по сравнению с вариантом I (табл. 3). Однако и в этом случае содержание растворимого белка при инокуляции ниже.

Активность ПО в корнях проростков гороха в оптимальных условиях роcта имела разную направленность изменений (табл. 4). В отрезках 0-20 мм от кончика корня активность ПО снижалась, а в более дифференцированных отрезках (20-40 мм от кончика корня) -возрастала.

Снижение активности ПО в определенном участке корня, обладающем наибольшей восприимчивостью к инфекции Rhizobium, как показано нами ранее (Акимова и др., 2002), достаточно специфично и, вероятно, способствует проникновению бактерий в корень.

При действии температуры 80С на проростки (I), как отмечалось выше, рост корня замедляется, резко снижаются скорость деления и растяжения клеток корня. При этом замедляется формирование корневых волосков и темпы внедрения ризобий (Акимова и др., 1999; Соколова, 2001). Активность ПО в первые двое суток воздействия гипотермии возрастала и затем постепенно сравнивалась с контрольным уровнем. Проникновение ризобий в корень растягивалось во времени (Акимова и др., 2002) и сопровождалось снижением активности ПО в отрезках инокулированных корней до завершения проникновения бактерий. Затем активность ПО повышалась (табл.5).

При действии температуры 80С с прорастания семян (II), адаптация растений к холоду, вероятно, происходила еще на стадии проклевывания семян и активность ПО не возрастала, а у инокулированных - даже снижалась (табл. 6). В варианте с растениями, инокулированными еще в семенах (III), проростки, вероятно, наиболее адаптированы к условиям низкой температуры, так как активность ПО значительно снижалась в первые двое суток, и, кроме того, в более короткие сроки сравнивалась с активностью фермента в контроле (табл. 7).

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что инокуляция несколько снижает, нивелирует отрицательное действие низкой температуры, что дает возможность растению быстрее адаптироваться к гипотермии и это, прежде всего, сказывается на росте всего корня. Активность ПО может служить индикатором реакции проростков гороха на холодовое воздействие. Снижение активности фермента, не только является необходимым условием начальных взаимодействий симбионтов (Акимова и др., 2002), но и свидетельствует об адаптационных изменениях в растении, происходящих в зависимости от вариантов воздействия температуры.

Более низкое содержание растворимого белка у инокулированных растений может быть обусловлено его гидролизом протеиназами, которые активируются не только под действием гипотермии (Дунаевский и др., 2005), но и инокуляции (Шумный, Сидорова, 1991). Высвобождающиеся при этом аминокислоты могут использоваться для синтеза новых белков-нодулинов, необходимых для дальнейшего развития симбиоза.

Таким образом, низкая температура и инокуляция Rhizobium вызывают изменения в содержании растворимого белка и активности ПО, что очевидно способствует, нормальному ходу метаболических процессов и обеспечивает регуляцию взаимодействия растений с Rhizobium при гипотермии.

Список литературы Влияние низкой температуры на содержание белка и активность пероксидазы при инокуляции гороха Rhizobium leguminosarum

Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В. (1999) Влияние инокуляции Rhizobium leguminosarum на рост корней гороха при пониженной температуре. Физиология растений, 46 (5), 806-810.
Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б., Сидорова К.К. (2002) Роль пероксидазы во взаимодействиях растений гороха с Rhizobium. Агрохимия, 12, 37-41.
Бузун Г.А., Джемухадзе К.М., Милешко Л.Ф. (1982) Определение белка в растениях с помощью амидо-черного. Физиология растений, 29 (1), 198-204.
Войников В.К., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Рихванов Е.Г. (2004) Стрессовые белки растений. Иркутск: Изд. Ин-та географии СО РАН, 129 с.
Газарян И.Г. (1992) Пероксидазы растений. М.: ВИНИТИ, Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология, 36, 4-28.
Гималов Ф.Р., Чемерис А.В., Вахитов В.А. (2004) О восприятии растением холодового сигнала. Успехи современной биологии, 124, 185-196.
Граскова И.А., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Войников В.К. (2004) Пероксидаза как компонент сигнальной системы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили. Физиология растений, 51(5), 692-697.
Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белякова Г.А., Домаш В.И., Шапиро Т.П., Забрейко С.А., Белозерский М.А. (2005) Ингибиторы протеиназ как антистрессовые белки высших растений. Прикладная биохимия и микробиология, 41(4), 392-396.
Жизневская Г.Я., Троицкая Г.Н., Бороденко Л.И., Измайлов С.Ф. (2001) Пероксидаза и каталаза в корневых клубеньках кормовых бобов при эффективном и неэффективном симбиозе с ризобиями. Физиология и биохимия культ. растений, 33, 285-290.
Карташева Е.Р., Руденская Г.Н., Юрина Е.В. (2000) Полифункциональность растительных пероксидаз и их практическое использование. Сельскохоз. биология, 5, 63-70.
Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. (1977) Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена. Биохимия, 42, 1372-1379.
Минибаева Ф.В., Гордон Л.Х. (2003) Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе. Физиология растений, 50, 459-464.
Обручева Н.В. (1982) Прорастание семян. Физиология семян (под ред. А.А.Прокофьева). М: Наука, 223-274.
Рогожин В.В., Верхотуров В.В., Курилюк Т.Т. (2001) Антиоксидантная система в прорастании семян пшеницы. Известия РАН. Сер. биол., 2. 165-173.
Савич И.М. (1989) Пероксидазы -стрессовые белки растений. Успехи соврем. биологии, 107(3), 406-417.
Соколова М.Г. (2001) Физиологические особенности начальных этапов инфицирования корней гороха Rhizobium leguminosarum при разных температурах: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Иркутск: СИФИБР СО РАН, 21с.
Тарчевский И.А. (2001) Патоген-индуцируемые белки растений. Прикладная биохимия и микробиология, 37(5), 517-532.
Тихонович И.А., Проворов Н.А. (1998) Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. Ст-Пб: Наука, 5-67.
Хадри А.-У., Бисселинг Т. (2002) Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями. Ред. Спайнк Г., Кондороши А., Хукас П.; Русский перевод под ред. Тихоновича И.А., Проворова Н.А. Ст-Пб: Россельхозакадемия, 435-450.
Шумный В.К., Сидорова К.К. (1991) Биологическая фиксация азота. Новосибирск: Наука. 271 с.
Cook D., Dreyer D., Bonnet D., Howell M., Nony E., Van den Bosch K. (1995) Transient induction of a peroxidase gene in Medicago truncatula precedes infection by Rhizobium meliloti. Plant Cell, 7(1), 43-55.
Peng H.M., Dreyer D.A., VandenBosh K.A., Cook D. (1996) Gene structure and differential regulation of the Rhizobium-induced peroxidase gene rip1. Plant Physiol., 112(4), 1437-1446.
Scheres B., Van Engelen F., Van der Knaap E. et al. (1990) Sequential induction of nodulin gene expression in the developing pea nodule. Plant Cell, 2(8), 687-700.
Verma D.P.S. (1992) Signals in root nodule organogenesis and endocytosis of Rhizobium. Plant Cell, 4, 373-382.
Spaink H.P. (1995) The molecular basis of infection and nodulation by Rhizobia: The ins and outs of sympathogenesis. Annu. Rev. Phytopatol., 33, 345-368.

Еще

Статья научная