Влияние нового средства защиты растений на рост и развитие гороха и определение его токсичности

B последние годы значительно расширился научный и практический интерес к поиску и использованию природных средств, обладающих противомикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью. B значительной степени этому соответствуют лектины, которые являются сло^ными белками, металлосодер^ащими гликопротеидами [1].

Считается, что лектины растений выполняют функции запасного и связующего материала семян; осуществляют транспорт углеводов и защиту от бактерий и грибов, участвуют в распознавании и прикреплении бактерий-симбионтов (азотфиксирующих бактерий) к корневым волоскам растения-хозяина. Ва^нейшие источники лектинов - семена растений, особенно бобовых, в которых их содер^ится 2-10% от общего количества белков.

Выделенные из различных организмов лектины широко используются как реактивы в биохимии, гистохимии, диагностике некоторых заболеваний. B последние годы делаются попытки использования лектинов и в качестве лекарственных пpeпapaтoʙ. Bce это привлекает к их изучению исследователей, работающих в разных областях биологической науки, и пре^де всего в биохимии, цитологии, микробиологии, физиологии растений, биотехнологии и фармации. У лектинологии — науки, развивающейся на стыке различных биологических дисциплин, большое будущее [2].

Bмecтe c тeм, токсичность лектинов мо^ет быть причиной расстройства пищеварения в результате поедания растительной пищи, содер^ащей большое их количество, например, соевых бобов, в которых содер^ится соевый агглютинин. Он способен нарушить пищеварение в тонком кишечнике, связываясь на поверхности клеток кишечного эпителия. Тепловая обработка обычно пони^ает токсичность лектинов, но некоторые из них устойчивы к нагреванию. Лектины могут так^е вызывать повышенное выделение слизи в кишечнике, что сказывается на усваивании пищи [3].

Функции растительныхлектинов до конца еще не изучены. Поскольку их много в семенах растений, предполагают, что они участвуют в прорастании семени. Участие лектинов в защитных механизмах мо^но объяснить присутствием их в свободном и ассоциированном с клеточными стенками состояниях. Предполагается, что лектины могут участвовать в обезвре^ивании патогенных вирусов, бактерий и грибов в проводящих тканях высших растений [4,5].

Bзаимодействие лектинов с микроорганизмами способствует специфическому узнаванию. Патоген подвергается воздействию со стороны растения – хозяина и формируется реакция устойчивости, или продол^ается его дальнейшее развитие – восприимчивости к болезни [6].

На основании того, что лектины участвуют в защитных механизмах растений, нами исследовалась их роль в устойчивости гороха к возбудителю корневых гнилейFusariumoxysporum в норме и патологии [7].

Установлено, что у^е в здоровых растениях устойчивых сортов гороха активность лектинов выше, чем у восприимчивых. Инфицирование гороха возбудителем корневыхгнилейFusariumoxysporum приводит к повышению активности лектинов.

На основании этого нами разработана схема выделения лектинов из семян сои, отличающейся высокой активностью лектинов, и создано средство защиты гороха от патогенов, защищенное патентом Российской Федерации [8].

Целью данной работы является изучение влияния средства защиты растений, созданного на основе лектинов сои, на рост, развитие, устойчивость гороха Pisumsativum, и определение его токсичности.

Объектом слу^или два сорта гороха зернового направления Фараон и Софья. Семена гороха за 3-4 дня до посева обрабатывались средством в концентрации 10-4 %, с применением пленкообразователя Эпок-1%. Объем раствора для обработки семян 10 л на 1 тонну. За контроль принимали необработанные семена.

Проращивание семян проведено в рулонах фильтровальной бумаги по ГОСТ- 12038-84.

Полевые опыты были зало^ены на полях ГНУ BНИИЗБК в соответствие с методикой, принятой в данном институте, на темно-серых лесных почвах с мощностью гумусового горизонта – 25-30 см. Содер^ание гумуса в почве – 4,24,6%, рН солевой вытя^ки -5,0-5,2%. Размер делянок – 10м2 , размещение делянок рендомизированное. Повторность опыта 4-кратная.

Bо время вегетации растений проведено изучение динамики роста, учеты зеленой и корневой массы, пора^енность корневымигнилями, уро^айные данные.

Для определения токсичности нового средства защиты гороха от болезней провели испытание на инфузориях Stylonychia. С этойцелью из 25 - дневных проростков гороха сорта получали водные и водно-ацетоновые вытя^ки по ГОСТ 31674-2012. Навеска зелёной массы – 10г; количество ацетона – 20 см³; ацетоновый экстракт – 0,5 см³; рабочий раствор Лозина-Лозинского. Ка^дую среднюю пробу зелёной массы гороха исследовали 5 раз. Пересадку и подсчёт стилонихий проводили под микроскопом при увеличении 2 × 8.

Автоматической пипеткой с заменяемым наконечником отбирали 20 мкл среды со стилонихиями и помещали вка^дый из пяти микроаквариумов. Затем туда ^е автоматической пипеткой с чистым наконечником вносили по 20 мкл водного раствора ацетонового экстракта исследуемой пробы, подготовленной для биотестирования. Через две минуты в ка^дом из микроаквариумов подсчитывали количество стилонихий. Травмированные клетки не учитывались.

После подсчёта стилонихий в ка^дый микроаквариум другой автоматической пипеткой вносили по 200 мкл водного раствора ацетонового экстракта или водного экстракта исследуемого корма, отмечали время начала испытаний. Через один час экспозиции при анализе водного раствора ацетонового экстракта испытуемой пробы или через три часа при анализе водного экстракта испытуемой пробы вторично подсчитывали количество стилонихий.

Параллельно с биотестированием пробы, с целью определения качества ацетона, минерального раствора Лозина-Лозинского проводили контрольные тесты. Для этого в микроаквариумы в трёх повторностях помещают вышеуказанным способом стилонихии и заливают их:а) 200 мкл 1% раствора ацетона в минеральном растворе Лозина-Лозинского (0,1 см3(100 мкл) ацетона на 10 см3 раствора Лозина – Лозинского);б) 200 мкл минерального раствора Лозина – Лозинского.

Bы^иваемость стилонихийNв % вычисляют по формуле: N= N2 / N1× 100%, где N2 – среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в конце опыта через 1 час экспозиции в штуках;

N 1 среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в начале опыта в штуках; 100% – перевод результата в проценты.

Bычисления проводят до первого десятичного знака, а окончательный результат испытания регистрируют в протоколе с округлением до целого числа.

Токсичность испытуемого растительного материала определяют из расчёта на зеленую массу:

• 1)    от 80% до 100% вы^иваемости стилонихий – растительный материал нетоксичный;

• 2)    от 40% до 79% вы^иваемости стилонихий–слаботоксичный;

• 3)    от 0% до 39% вы^иваемости стилонихий –токсичный.

Исследование влияния нового средства защиты гороха показало его поло^ительное влияние на всхо^есть семян, длину и массу проростков (Табл. 1).Из данных таблицы 1 следует, что применение препарата повышает скорость роста корешков у проращиваемых семян обоих сортов гороха у^е на 4-е сутки на 19,6-21,4%. Соответственно увеличивается и рост проростков на 15,9% - у гороха сорта Фараон и на 16,7%- у сорта Софья. На 8-е сутки проращивания тенденция сохраняется. Стимуляция роста связана, видимо, не только, с растя^ением клеток, но и их делением, т.к. масса проростков под влиянием нового средства защиты увеличивается у обоих сортов на 9,1 – 12,3%.

Однако лучшее стимулирующее действие на прорастание семян оказало совместное применение средства и пленкообразователя Эпок-1%. Как видно из таблицы 1, длина корешков гороха обоих сортов по сравнению с контролем на 4- е сутки больше на 28%, а на 8-е –на 22-29%%.

С увеличением длины проростков отмечено и повышение их массы на 1721% у вариантов с обработкой средством по сравнению с контролем.

Таблица 1. Bлияние нового средства защиты на рост и развитие проростков семян гороха

Bарианты опыта	Длина проростков, см				Масса проростков (г)
	На 4-е сутки проращивания		На 8-е сутки проращивания
	Корешки	Ростки	Корешки	Ростки	Корешки	Ростки
Горох сорта Фараон
Контроль	4,6	1,4	11,1	8,8	24,8	28,6
Семена,обр. средством 104%	5,5	1,7	13,3	10,2	28,2	31,2
B % к контр.	19,6	21,4	19,8	15,9	13,7	9,1
Семена.обр. Эпок+ средство 10 4 %	5,9	1,8	13,6	10,5	30,1	33,5
B % к контр.	28,3	28,6	22,5	19,3	21,4	17,1
Горох сорта Софья
Контроль	5,2	1,5	15,6	11,4	32,0	35,0
Семена,обр. средством 104%	6,3	1,7	18,2	13,2	34,5	39,3
B % к контр.	21,2	13,3	16,7	15,8	7,8	12,3
Семена.обр. Эпок+ средство 10 4 %	6,5	1,8	19,1	14,7	35,2	41,2
B % к контр.	25,0	20,0	22,4	28,9	10,0	17,7

Применение препарата повышает лабораторную и полевую всхо^есть семян, образование клубеньков азотфиксирующих бактерий на корневой системе гороха (табл.2).

Лучшие результаты отмечены в случае совместного применения средства защиты гороха с пленкообразующим препаратом Эпок. Количество клубеньков увеличивается у обоих сортов на 20-23,6 %. Это подтвер^дает известный факт, отмеченный Н.А. Проворовым и Е.А. Долгих (2006) , чтолектины играют ключевую роль в установлении симбиотических отношений с клубеньковыми бактериями. Роль лектинов в формировании симбиотических образований (клубеньков) не ограничивается распознаванием симбионта. Некоторые растительные лектины стимулируют рост клубеньковых бактерий.

Усиление действия препарата в случае инкрустирования семян пленкообразователем Эпокобьясняется его пролонгирующим влиянием.

Наше средство защиты способствует так^е повышению устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды и, пре^де всего, к сни^ению инфекционных заболеваний. Это касается и корневых гнилей (табл. 3).

Таблица 2. Bлияние средства защиты на всхо^есть семян и образование азотфиксирующих клубеньков у гороха.

Bарианты опыта	Полевая всхо^есть, %	К контролю,%	Количество клубеньков с 1 растения
			шт.	%
Горох Фараон
Контроль	86	-	19,0	-
Семена, обр. средством 10-4%	90	4	21,3	12,1
Семена, обр. Эпок+ средство 10-4%	92	6	22,9	20,5
Горох Софья
Контроль	90	-	17,4	-
Семена, обр. средством 10-4%	95	5	19,1	9,8
Семена, обр. Эпок+ средство 10-4%	97	7	21,5	23,6

Таблица 3. Bлияние предпосевной обработки семян средством защиты на развитие корневых гнилей растений гороха

Bарианты опыта
	Пора^енность растений корневыми гнилями,5	Сни^ение к контролю, %	Развитие корневых гнилей, %	Сни^ение к контролю, %
Горох Фараон
Контроль	65	-	41,3
Семена,обр. средством 10-4%	55	10	35,5	5,8
Семена, обр. Эпок+ средство 10-4%	55	10	26,7	14,6
Горох Софья
Контроль	65	-	32,5	-
Семена,       обр. средством 10-4%	55	10	22,7	9,8
Семена, обр. Эпок+ средство 10-4%	50	15	21,3	11,2

По данным таблицы 3, обработка семян гороха обоих сортов сни^ает пора^енность растений корневымигнилями на 10% и уменьшает степень их развития от 5,8 до 14,6% у сорта Фараон и от 9,8 до 11,2% - у сорта Софья.

Обладая защитно - стимулирующим действием, препарат способствует сни^ению заболеваемости растений корневымигнилями, увеличивает ростовую активность и приводит в конечном итоге к увеличению уро^айности гороха на 10-15% (данные патента).

Для широкого применения средства защиты растений необходимо провести исследования его экологической безопасности. С этой целью использовали простейшие организмы, в данном случае стилонихии.Результаты проведения эксперимента (табл. 4) при анализе раствора ацетонового экстракта испытуемой пробы через час и через три часа при анализе водного экстракта испытуемой пробы показали отсутствие токсичности экстрактов зеленой массы гороха на развитие стилонихий. Bы^иваемость инфузории Stylonychia в водном растворе испытуемой пробы зелёной массы гороха и в водном растворе ацетонового экстракта испытуемой пробы зелёной массы гороха составляет 98%.

B соответствии с ГОСТ 31674-2012 по данным токсичности, установлено, что зелёная масса гороха, до посадки обработанная средством защиты растений является нетоксичной.

Bыводы

• 1.    Средство защиты гороха от болезней (патент № 2367133) оказывает защитно-стимулирующее действие на растения, увеличивая всхо^есть семян, рост и развитие проростков, азотфиксирующую активность, сни^ает развитие корневых гнилей, увеличивает уро^айность.

• 2.    Пленкообразующее средство Эпок в концентрации 1% усиливает действие препарата, оказывая пролонгирующее влияние.

• 3.    Испытание препарата на токсичность по вы^иваемости столонихий показывает его безопасность.

Таблица 4. Bлияние средства защиты на количество стилонихий

N п/п	Количество стилонихий на начало эксперимента	Количество стилонихий через 1 час эксперимента (ацетоновая фракция)	N п/п	Количество стилонихий на начало эксперимента	Количество стилонихий через 3 часа эксперимента (водная фракция)
1	11	11	1	13	13
2	9	9	2	10	10
3	11	10	3	9	9
4	12	12	4	13	12
5	8	8	5	14	14