Влияние новых изолятов молочнокислых бактерий на развитие и выживание гидробионтов

В настоящее время аквакультура в России набирает стремительные обороты благодаря внедрению высокоинтенсивных методов выращивания гидробионтов. Однако при выращивании рыб в искусственных условиях наблюдается повышение уровня органического загрязнения водной среды и, как следствие, увеличение числа патогенных микроорганизмов. В результате ухудшения экологических условий, связанных с высоким уровнем кормления и большой плотностью посадки, снижается устойчивость гидробионтов к стрессовым факторам, что, в конечном счете, приводит к снижению темпа роста, устойчивости к заболеваниям, увеличению смертности. Традиционно в аквакультуре для лечения и профилактики заболеваний гидробионтов используют химические вещества, в том числе антибиотики. Однако их воздействие может спровоцировать появление устойчивых мутагенных микробных штаммов, неблагоприятно влияющих на здоровье рыб [Jahangiri, 2018; Tarnecki, 2019].

Для нормализации условий, следует использовать пробиотические добавки, которые стимулируют оптимизацию протекания обменных процессов. В России на сегодняшний день уделяется большое внимание созданию эффективных пробиотических препаратов, использующихся в составе кормов для гидробионтов. Пробиотические препараты содержат в своем составе стабилизированные культуры микроорганизмов и продукты их ферментации, обладающие набором полезных свойств [Ушакова и др., 2012; Орлова, 2019]. Они стимулируют рост естественной микробиоты, повышают неспецифический иммунитет, а также подавляют рост и развитие условно-патогенных и па-

тогенных микроорганизмов. Как известно, пробиотики не оказывают отрицательного воздействия на микрoбиоту пищеварительного тракта, не загрязняют продукты рыбоводства и окружающую среду [Юрина, 2015; Артюхова, Клюева, 2015].

В технологии производства многих российских пробиотических препаратов используются импортные заквасочные культуры, имеющие достаточно высокую цену. В связи с этим разработка новых пробиотических препаратов на основе активных штаммов молочнокислых бактерий является актуальным и перспективным направлением.

Цель работы – исследование влияния новых изолятов молочнокислых бактерий в составе стартовых кормов на рост и развитие аквариумных рыб.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

• 1.    Выделение чистых культур молочнокислых бактерий из различных естественных источников.

• 2.    Отбор наиболее активных изолятов молочнокислых бактерий на основании изучения физиолого-биохимических признаков.

• 3.    Характеристика биологической эффективности использования молочнокислых бактерий в составе стартовых кормов.

Материалы и методы исследования

Источниками выделения для молочнокислых бактерий являлись молочная продукция домашнего производства (творог, брынза, сметана); квашеные овощи промышленного производства (капуста, томат) и домашнего приготовления (капуста, перец, чеснок). Выделение молочнокислых бактерий осуществляли на плотных и в жидких средах Бликфельдта при 37°С. Получение чистых культур, определение каталазной, оксидазной, протеолитической, амилолитической, сахаролитической и кислотообразующей активности проводили с использованием общепринятых методов. Определение устойчивости к желчи проводили на жидкой питательной среде, содержащей 0.5, 20.0 и 40.0% желчи в течение 24 ч. Способность бактерий расти в присутствии NaCl исследовали на жидкой питательной среде с добавлением соли в концентрации 5, 10 и 15% в течение 24 ч. Идентификацию микроорганизмов проводили на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков [Нетрусов и др., 2005; ГОСТ 33951-2016].

Изучение эффективности использования молочнокислых бактерий в составе кормов проводили с помощью наиболее активных изолятов, которые обладали достаточно высокой активностью кислотообразования, желче- и солеустойчивостью. Для получения жидкой формы препаратов готовили бактериальные суспензии с единой концентрацией клеток. В качестве сорбента применяли корм для аквариумных рыб – перетертых дафний. Жидкие формы препаратов вносили в корм путем орошения водным раствором добавок с последующим подсушиванием. Растворы распыляли равномерным слоем стерильными пульверизаторами. Подсчет клеток осуществляли в счетных камерах Горяева [Бурлаченко, 2008].

Определение влияния изолятов проводили на 2-суточных аквариумных рыбах гуппи, которые были разделены на 5 групп: контрольную и четыре опытных по 20 голов в каждой. Технология содержания во всех вариантах идентична и выполнена в соответствии с методиками (проводилась искусственная aэрация, фильтрация и подогрев воды в каждом аквариуме). Кормление контрольной группы осуществляли кормом без внесения добавок, а опытных групп – кормами, содержащими в своем составе по 1 изоляту молочнокислых бактерий в единой концентрации. Кормление производили дважды в сутки с промежутком в 7 ч. О действии препаратов судили по рыбоводно-биологическим характеристикам, что характеризовало действие препаратов на состояние молоди. В качестве рыбоводно-биологических показателей были взяты абсолютный и среднесуточный прирост, коэффициент массонакопления, а также выживаемость рыб в выборке. Взвешиванию и измерению подвергали всех рыб контрольной и опытной групп. Выживаемость выражали в процентах от общего количества рыб. Продолжительность опыта составила 60 сут. [Бурлаченко, 2008].

Результаты и их обсуждение

В результате исследований выделено 9 изоля-тов молочнокислых бактерий (табл. 1). При культивировании молочнокислых бактерий на плотной питательной среде установлено, что изоляты формируют гладкие выпуклые колонии светлобежевого цвета, с ровным краем, однородной консистенцией. При культивировании изолятов в жидкой питательной среде наблюдалось изменение pH, помутнение среды и появление осадка. При микроскопировании обнаружены грамположительные неспорообразующие палочки в цепочках и грампо-ложительные кокки в цепочках с различным размером клеток.

Выявлено, что изоляты обладают достаточно хорошей активностью кислотообразования (56.5‒110 Тº), что является одним из главных критериев отбора молочнокислых бактерий при разработке новых пробиотических препаратов. Также изоляты обладают выраженной сахаролитической активностью – расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу и галактозу: не образуют каталазу, оксидазу, амилазу, протеазу и цитохромы. Это свидетельствует о том, что данные показатели соответствуют родовой характеристике молочнокис- лых бактерий.

Таблица 1

Физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий

Показатель	Изоляты молочнокислых бактерий
	№ 1	№ 2	№ 3	№ 4	№ 5	№ 6	№ 7	№ 8	№ 9
Источник выделения	брынза	брынза	творог	капуста	сметана	чеснок	капуста	перец	чеснок
Оксидаза	-	-	-	+	+	-	-	-	-
Каталаза	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Цитохромы	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Протеаза	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Амилаза	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Липаза	0	0.1	0.7	0.1	0.5	0	0.4	0.3	0.1
Активность кисло-тообразования, ч	80	70	100	20	95	75	70	75	55
Сбраживание углеводов
Глюкоза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Лактоза	+	+	+	-	+	+	+	-	+
Сахароза	+	+	+	+	+	+	+	-	+
Мальтоза	+	+	+	+	+	+	+	-	+
Галактоза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Рост в жидкой среде, содержащей NaCl, %
5	+	+	+	+	+	-	+	+	+
10	+	+	+	+	+	-	-	-	+
15	-	+	+	-	+	-	-	-	-
Рост в жидкой среде, содержащей желчь, %
0.5	+	+	-	+	+	-	-	+	+
20	+	+	-	+	-	-	-	+	+
40	+	+	-	-	-	-	-	-	+

Одним из основных критериев для отбора производственно-ценных штаммов с пробиотическими свойствами является оценка толерантности молочнокислых бактерий к желчи и солености. Исследования показали, что все исследуемые изоляты, кроме одного (№ 6), способны развиваться в присутствии 5%-ного NaCI. На основании полученных данных можно выделить три солеустойчивых изо-лята (№ 2, 3, 5), развивающихся при концентрации NaCl 15%, и шесть слабогалофильных (№ 1‒5, 9). Кроме этого, установлено, что шесть изолятов (№ 1-, 2-, 4-, 5-, 8-, 9-й) способны развиваться при низких концентрациях желчи, при концентрации 20% развиваются пять изолятов (№ 1-, 2-, 4-, 8-, 9й), а при максимальной концентрации (40%) – 3 изолята (№ 1-, 2-, 9-й).

На основании результатов изучения физиологобиохимических свойств и способности культивирования при сохранении свойств в лабораторной культуре для дальнейших исследований выбраны 4 изолята (№ 1-, 2-, 3-, 5-й), которые рассматривались в качестве добавки в составе кормов для аквариумных рыб.

В результате включения в рацион отобранных изолятов, обладающих пробиотическими свойствами, происходит улучшение рыбоводнобиологических показателей рыб (табл. 2). Подопытные рыбы по всем вариантам опыта потребляли внесенную порцию корма за одинаковый период времени – 2‒3 мин. Это свидетельствует о том, что изоляты не ухудшают вкусовые качества корма.

Таблица 2

Рыбоводно-биологические показатели выращивания молоди гуппи

Показатели	Варианты опыта
	№ 1	№ 2	№ 3	№ 5	К
Масса начальная, г	0.01±0.001	0.01±0.001	0.01±0.001	0.01±0.001	0.01±0.001
Масса конечная, г	0.33±0.08	0.5±0.15	0.33±0.03	0.38±0.06	0.33±0.03
Длина начальная, см	0.6±0.1	0.6±0.1	0.6±0.1	0.6±0.1	0.6±0.1
Длина конечная, см	1.16±0.29	1.76±0.14	1.4±0.14	1.63±0.15	1.4±0.18
Кормовой коэффициент, ед.	1.09	1.02	1.1	1.08	1.08
Абсолютный прирост, г	0.32	0.49	0.32	0.37	0.32
Продолжительность опыта, сут.	60	60	60	60	60
Среднесуточный прирост, г/сут.	0.005	0.008	0.005	0.006	0.005
Среднесуточная скорость роста, %	6	6.73	6	6.25	6
Коэффициент массонакопления, ед.	0.023	0.028	0.023	0.025	0.023

При наблюдении за тест-объектами отклонений в поведении не обнаружено: рыбы активно передвигались в толще воды, реагировали на звуковые и тактильные раздражения. И в опыте, и в контроле наблюдался прирост массы рыб. Абсолютный прирост в варианте с добавлением изолята № 2 составил 0.49 г, что в 1.5 раза больше, чем в контрольном варианте, где прирост составил 0.32 г. Длина рыбы в опытных группах (№ 2 – 1.76±0.14; № 5 – 1.63±0.15) также несколько выше, по сравнению с контролем (1.4±0.18). Сохранность рыб в период эксперимента составила 90%, что свидетельствует об отсутствии отрицательного влияния добавок на основе изучаемых изолятов. При использовании изолята № 2 скорость роста молоди гуппи увеличилась на 30%, № 5 – на 15% по сравнению с этим же показателем в контрольном варианте.

Поедание корма во всех группах одинаково, так как кормление проводили нормировано. Однако при скармливании корма с изолятом № 2 кормовой коэффициент ниже (1.02), чем в контроле (1.08).

Таким образом, в ходе проведенного эксперимента установлено положительное действие изоля-тов № 2 и 5 на развитие тест-объектов, что не только повышает эффективность используемых кормов при выращивании аквариумных рыб, но и свидетельствует одновременно о биологической безопасности исследуемых культур.

Заключение

В результате эксперимента доказано, что все рыбоводные показатели выше в группах, получавших корм с добавлением изолятов № 2 и 5 по сравнению с контролем, на основании чего можно констатировать, что изоляты оказывают положительное действие. Положительный эффект применения добавок, возможно, объясняется тем, что добавляемые в состав кормов изоляты, обладают определенным набором пробиотических свойств, в том числе наличием ферментов, способствующих быстрому расщеплению и лучшему усвоению пищи.

Несмотря на все преимущества применения бактериальных культур в составе пробиотических препаратов, многие хозяйства все же отказываются из-за их высокой стоимости и неуверенности в положительных производственных результатах. Однако практика показывает, что применение пробиотических добавок дает ощутимый эффект, а расходы на них компенсируются повышением показателей продуктивности гидробионтов [Буяров, Юшкова, 2017].