Влияние односторонней перевязки седалищного нерва на состояние крыс-опухоленосителей с особенностями системной регуляции

Увеличение с возрастом распространенности онкологических заболеваний, а также патологий, сопровождающихся болевым синдромом, определяет актуальность изучения влияния хронической боли на опухолевый процесс и состояние организма при одновременном выявлении факторов, модулирующих такое влияние. Известно, что развитие болевого синдрома имеет многоуровневый характер и связано с изменениями в центральных и периферических структурах нейроэндокринной и иммунной систем [1–3]. При этом результат болевого воздействия, как и воздействия любой другой модальности, должен зависеть от интенсивности действующего фактора и состояния нейроэндокринной регуляции [4, 5].

Целью исследования явилось изучение влияния односторонней перевязки седалищного нерва на рост перевивной опухоли и продолжительность жизни экспериментальных животных, имеющих отличия в адаптационном статусе и темпах старения.

Материал и методы

Эксперименты проводили на 29 белых беспородных крысах-самцах одинакового возраста, который к началу эксперимента составил 6 мес. В основную группу вошли 16 животных, у которых производили одностороннюю перевязку седалищного нерва (ПСН) по G.J. Bennet [6]. Ложной операции, включавшей выделение и кратковременную фиксацию нерва (в течение 10 с) без его перевязки, были подвергнуты 7 самцов. Контрольную группу без хирургического вмешательства составили 6 животных. Через 4 нед после операции крысам всех трех групп проводили трансплантацию карциномы Герена в стандартном режиме путем подкожного введения в боковую поверхность задней части спины взвеси в объеме 0,5 мл, содержащей физиологический раствор и 0,3 мл клеточной массы. В течение последующих 2 мес оценивали динамику роста опухоли, рассчитывая ее объем по формуле Шрека для эллипсоидов. Продолжительность жизни животных определяли со дня трансплантации опухоли. При проведении исследований соблюдали международные правила гуманного обращения с лабораторными животными.

Перед началом эксперимента и на его этапах определяли двигательную активность животных с помощью теста «открытое поле» [7]. Для этого использовали компьютеризированную установку «Открытое поле» TS0501 типа «ринг» (OOO «HПK Oкрытая Hayка», г. Красногорск). Различные элементы двигательной активности фиксировали в течение 5 мин. Оценивали горизонтальную и вертикальную двигательную активность в целом, вычисляя показатель общей двигательной активности животных как сумму числа пересечений квадратов в центре, числа пересечений квадратов во второй трети площади поля, числа пересечений квадратов на периферии, а также количества стоек с опорой на стену и стоек без опоры на стену. При этом отмеченные до начала эксперимента значения показателя общей двигательной активности учитывали при распределении животных по группам для обеспечения межгруппового сходства в относительном числе крыс с «высокими», «умеренными» и «низкими» значениями показателя.

Изучение адаптационного статуса подопытных крыс проводили с помощью гематологических показателей характера и напряженности общих неспецифических адаптационных реакций организма (АР) [4, 8]. Цитологический анализ крови проводили раз в неделю с помощью гемоанализатора «Exigo EOS vet» (Boule Medical A.B., Швеция). Наблюдение за экспериментальными животными осуществляли в течение 4 нед до трансплантации карциномы Герена и 2 мес после перевивки опухоли вплоть до гибели последнего животного.

При статистической обработке полученных результатов использовали стандартный пакет программ «Statistica 6». Для описания и оценки межгрупповых и внутригрупповых различий применяли коэффициент вариации (CV), критерии Вилкоксона–Манна–Уитни и t-критерий Стьюдента (для сравнения долей).

Результаты и обсуждение

Изучение поведения животных с помощью теста «открытое поле» до начала эксперимента позволило выделить три диапазона значения показателя общей двигательной активности, соответствовавших низкому (13–15), среднему (40–74) и высокому (88–110) уровням. Соотношение числа животных с разным уровнем двигательной активности составило 5:15:9. Показатели, полученные через 4 нед после операции, накануне трансплантации опухоли, свидетельствовали об отсутствии заметного изменения двигательной активности в контрольных группах и снижении показателя (до 2–6 раз в большинстве случаев) у крыс с ПСН по сравнению с уровнем их двигательной активности до операции (p<0,001). При этом не было выявлено особенностей в степени снижения данного показателя у животных с разным уровнем двигательной активности. Выраженное снижение показателя двигательной активности в основной группе могло указывать на развитие хронического нейрогенного болевого синдрома, обусловленного ПСН.

Изучение динамики злокачественного роста в экспериментальных группах позволило выявить изменения, вызванные хирургическим вмешательством и ПСН. Через 2 нед после трансплантации опухоли, до начала гибели животных, при сходстве минимальных размеров опухолей в исследованных группах было отмечено увеличение диапазона значений объема карциномы Герена у животных в группах с ПСН и с ложной операцией в 1,5 раза по сравнению с диапазоном значений этого показателя в контрольной группе (табл. 1). При этом величина коэффициентов вариации размеров опухоли во всех группах превышала 33 %, что свидетельствовало о неоднородности соответствующих выборок и, очевидно, отражало внутригрупповые различия в темпах роста карциномы Герена на рассматриваемом этапе. Если у животных, подвергнутых ложной операции и ПСН, такую особенность роста можно было бы связать с индивидуальными реакциями организма на проведенные вмешательства, то в отношении крыс контрольной группы вопрос о возможных причинах такой «неравномерности» развития опухоли оставался без ответа.

Через 3,5 нед после перевивки и спустя несколько дней после первых случаев гибели животных в группе с ПСН наблюдалось еще более выраженное увеличение диапазона размеров опухоли (в 2,4 раза) по сравнению с показателем в контрольной группе. Это было обусловлено как случаями более быстрого, так и случаями более медленного по сравнению с отмеченным в контрольной группе роста карциномы Герена. Именно у животных с ПСН на рассматриваемом этапе встречались опухоли минимального (20 см3) и максимального (93 см3) размеров (табл. 1). В группе животных с ложной операцией минимальный размер опухоли (21 см3) практически совпадал с этим показателем при ПСН, а максимальный размер был таким же, как в контрольной группе, то есть заметно ниже (в 1,4 раза), чем при ПСН. На рассматриваемом этапе значения коэффициентов вариации объема опухоли в исследованных группах (≥33 %) свидетельствовали о неоднородности показателя у животных с ПСН и ложной операцией, тогда как значение коэффициента вариации в контрольной группе опустилось несколько ниже критического значения (табл. 1).

Спустя 4,5 нед после трансплантации, после дальнейшей гибели животных диапазон изменения размеров опухолей и значения коэффициента вариации в контрольной группе значительно снизились по сравнению с предыдущим этапом – с 28 до 10 %. При этом в двух других группах, напротив, размах вариации заметно увеличился, и вариабельность объема карциномы Герена оставалась высокой (табл. 1). У значительной части прооперированных крыс темпы роста опухоли были выше, чем в контроле, не менее чем у 30 % животных групп с ложной операцией и с ПСН размеры карциномы Герена превышали 100 см3, тогда как в контрольной группе такие случаи не наблюдались (табл. 1). В то же время у отдельных прооперированных животных (по 2 случая в группе с ложной операцией и группе с ПСН) отмечено торможение роста опухоли, что выражалось в снижении объема карциномы Герена более чем в 1,5 раза по сравнению с минимальными размерами опухоли в контрольной группе (табл. 1).

Минимальная и максимальная продолжительности жизни самцов контрольной группы состави- ли соответственно 20 и 38 дней. При этом размеры карциномы Герена накануне гибели животных варьировали в широком диапазоне (от 26 до 117 см3), демонстрируя высокую вариабельность указанного показателя (CV – 43 %). Высокой вариабельностью отличались размеры опухолей накануне гибели животных в группах с ложной операцией и с ПСН, CV – 40 и 37 %. При этом размах вариации данного показателя в этих группах в 1,2 и 1,6 раза превышал диапазон контрольных значений, а максимальные размеры карциномы Герена в 1,3 и 1,5 раза были выше максимальных значений в контрольной группе (табл. 1).

Обращал на себя внимание неоднозначный характер связи темпов роста опухоли и продолжительности жизни прооперированных животных.

таблица 1/table 1

особенности роста карциномы Герена и продолжительность жизни крыс-опухоленосителей при односторонней перевязке седалищного нерва и ложной операции

Features of the guerin’s carcinoma growth and the lifespan of tumor-bearing rats with unilateral sciatic nerve ligation and false operation

	Показатели/Группы		Контроль/	Ложная операция/	ПСН/SNL
	Indicators/Groups		(n=6)	False operation (n=7)	(n=16)
2 нед после транс-	Размеры	Размах вариации (границы диапазона)/	16	24	25
	опухоли/	Range (range limits)	(12–28)	(12–36)	(12–37)
плантации опухоли/ 2 weeks after tumor	Тumor	± m, см3: CV, %	20,0 ± 3,2	19,1 ± 3,3	24,5 ± 2,1
transplantation	size		39	45	34
		Павшие животные/Mortality	0 (0 %)	0 (0 %)	0 (0 %)
3,5 нед после транс-	Размеры	Размах вариации (границы диапазона)/	30	46	73
	опухоли/	Range (range limits)	(37–67)	(21–67)	(20–93)
плантации опухоли/ 3.5 weeks after tumor	Тumor	± m, см3:	53,6 ± 7,5	35,7 ± 9,4	56,2 ± 5,2
	size	CV	28 %	59 %	33 %
transplantation
		Павшие животные/ Mortality	17 (1)	14 (1)	12 (2)
	Размеры	Размах вариации (границы диапазона)/	16	102	91
4,5 нед после транс-	опухоли/	Range (range limits)	(79–95)	(36–138)	(48–139)
	Тumor	± m, см3:	86.7 ± 4.9	82,3 ± 17,4	98,7 ± 11,2
плантации опухоли/ 4.5 weeks after tumor	size	CV	10 %	47 %	32 %
transplantation	Животные с опухолями объемом более 100 см3/		0	2 (33 %)•	3 (33 %)•
	Animals with a tumor size of more than 100 cm3
		Павшие животные/Mortality	2 (33 %)	1 (14 %)•♦	7 (44 %)
	Размеры	Размах вариации (границы диапазона)/	91	120	144
	опухоли/	Range (range limits)	(26–117)	(30–150)	(36–180)
Накануне гибели/	Тumor	± m, см3:	77,5 ± 22,2	109,0 ± 21,6	106,0 ± 10,1
On the eve of death	size	CV	43 %	40 %	37 %
	Животные с опухолями объемом более 100 см3/ Animals with a tumor size of more than 100 cm3		1 (17 %)	4 (57 %)•	11 (69 %)•
Продолжительность жизни после трансплантации опухоли, сут/			20–38	20–64	23–56
Lifespan after tumor transplantation, days
Животные с продолжительностью жизни более 38 сут/			0	3 (43 %)•	7 (44 %)•
Animals with a lifespan of more than 38 days

Примечания: ПСН – перевязка седалищного нерва; CV – коэффициент вариации; • – значимые различия по сравнению с контрольной группой (p<0,05); ♦ – значимые различия по сравнению с группой ПСН (p<0,05–0,01). Критерий Вилкоксона–Манна–Уитни, t-критерий Стьюдента (сравнение долей).

Notes: SNL – sciatic nerve ligation; CV – the coefficient of variation; • – it differs from the values in the control group (p <0.05);

• ^♦ – it differs from the values in the SNL group (p<0.05–0.01); Wilcoxon–Mann–Whitney test, Student’s t-test (comparison of shares).

Так, несмотря на случаи ускорения роста опухоли при ПСН и ложной операции, более чем у 40 % животных этих групп наблюдалось увеличение продолжительности жизни относительно максимального значения этого показателя в группе контроля (38 дней) – до 40–64 дней от трансплантации опухоли (табл. 1). Таким образом, в группах с ПСН и ложной операцией гибель некоторых животных наступала в более поздние сроки и при более значительных размерах карциномы, чем у крыс, не подвергавшихся оперативному вмешательству и перевязке седалищного нерва.

Полученный результат отличался от описанного другими авторами эффекта двусторонней перевязки седалищного нерва у мышей-самок линии С57ВL/6 с перевивной меланомой В16/F10, заключавшегося в ускорении злокачественного роста и метастазирования, а также в снижении продолжительности жизни животных [9]. Очевидно, болевое воздействие при односторонней ПСН было существенно слабее, чем при двусторонней ПСН. Можно предположить, что в ряде случаев, обусловленных индивидуальной чувствительностью и особенностями системной регуляции, когда одностороннее хирургическое вмешательство и ПСН не достигали интенсивности стрессогенных факторов, имела место некоторая активизация регуляторных процессов. Это приводило к ослаблению системного повреждающего влияния опухоли на организм и даже у отдельных животных могло вызвать мобилизацию противоопухолевых механизмов, проявившуюся в торможении роста карциномы Герена. На правомерность данного предположения указывает обнаруженная связь между динамикой адаптационного статуса перед перевивкой карциномы Герена и последующим развитием опухоли и продолжительностью жизни крыс-опухоленосителей (табл. 2).

Так, случаи перехода напряженных антистрес-сорных АР спокойной и повышенной активации в АР стресс при снижении уровня гемоглобина более чем на 10 % накануне трансплантации опухоли в дальнейшем характеризовались низкой продолжительностью жизни (20–33 дня) при умеренных или быстрых темпах роста опухоли. Животные, у которых по гематологическим показателям было отмечено улучшение характеристик АР при высоком уровне гемоглобина (174 г/л и более), в дальнейшем отличались продолжительностью жизни, превышавшей максимальное значение этого показателя в группе контроля (табл. 2). При этом темпы роста опухоли у таких крыс могли не отличаться от показателей у животных с низкой продолжительностью жизни. В наиболее благоприятных случаях, при торможении роста карциномы Герена, в период до трансплантации опухоли, наблюдалось развитие стойкой АР повышенной активации с наименее выраженными признаками напряженности и наиболее высоким уровнем лимфоцитов (до 80 %). У таких животных отмечено таблица 2/table 2

Изменение характеристик общих неспецифических адаптационных реакций организма до трансплантации карциномы Герена у крыс групп c ложной операцией и перевязкой седалищного нерва, отличавшихся продолжительностью жизни и динамикой опухолевого процесса changes in the characteristics of general nonspecific adaptive reactions of the body before the transplantation of guerin’s carcinoma in rats of groups with a false operation and sciatic nerve ligation, differing in lifespan and dynamics of tumor size

Изменение продолжительности жизни (ПЖ) и особенности развития опухоли/ Change of lifespan and features of tumor development	Характеристики АР/ AR characteristics	Динамика уровня гемоглобина в крови/ Dynamics of hemoglobin level
Снижение ПЖ при быстром или умеренном росте опухоли/Reduction of the lifespan with rapid or moderate tumor growth	Напряженные СА/ПА (моноцитоз)→Стр/ Tensioned СА/EА (monocytosis)→Stress	Снижение на 11–14 %/ Decrease by 11–14 %
Увеличение ПЖ при быстром или умеренном росте опухоли/ Increase in the lifespan with rapid or moderate tumor growth	Улучшение характеристик АР: снижение выраженности признаков напряженности, случаи перехода Тр в ПА/Improving the characteristics of AR: reducing the severity of signs of tension, cases of transition TR to EA	Преимущественно высокий/ Mostly high level
Увеличение ПЖ при торможении роста опухоли/ The increase in the lifespan because of the inhibition of tumor growth	Стойкая ПА при относительном числе лимфоцитов до 80 % Stable EA with relative number of lymphocytes up to 80 %	Снижение на 5–7 % при исходном уровне более 170 г/л ◘ Decrease by 5–7 % at the initial level of more than 170 g/l ◘

Примечания: ПЖ – продолжительность жизни; АР – общие неспецифические адаптационные реакции, СА – АР спокойной активации, ПА – АР повышенной активации, Тр – АР тренировки, Стр – АР стресс; ◘ – отличается от значений, отмеченных при снижении ПЖ (p<0,05, t-критерий Стьюдента).

Notes: AR – general non-specific adaptational reactions, CA – AR of calm activation, EA – AR of elevated activation, TR – AR of training, stress – AR stress; ◘ – it differs from the values marked in the cases of decrease in lifespan (p<0.05, Student’s t-Test).

незначительное (до 7 %) уменьшение исходно высокого уровня гемоглобина перед перевивкой опухоли, менее выраженное по сравнению со снижением этого показателя у крыс с минимальной продолжительностью жизни (табл. 2).

Представлял интерес вопрос о причинах весьма значительной вариабельности исследованных показателей у подопытных животных. При анализе индивидуальных характеристик крыс-опухоленосителей до начала эксперимента была отмечена выраженная внутригрупповая разница в массе тела. Несмотря на близкие (в пределах 1 мес) сроки рождения животных, по достижении ими возраста 6 мес проявились четкие различия в размерах и массе тела крыс-самцов. Таким образом, в каждой из групп можно выделить две подгруппы животных. Подгруппа 1 включала особей весом 300–340 г, в подгруппу 2 вошли более крупные животные – весом 390–480 г. При этом в состав подгруппы 1 входило 3–9 крыс, в состав подгруппы 2 – 3–7 животных. Известно, что у крыс рост тела при прочих равных условиях может отражать темпы старения животных [10, 11]. Различие в темпах старения, обусловленное особенностями системной регуляции и метаболизма [11–13], могло оказать влияние на состояние организма и динамику злокачественного процесса. Справедливость этого предположения подтверждена результатами сравнения исследованных показателей у крыс разных подгрупп. В табл. 3 представлены сведения о внутригрупповых различиях продолжительности жизни и размеров карциномы Герена через 2 нед после трансплантации опухоли – до начала гибели животных в исследованных группах.

В контрольной группе и группе с ложной операцией особи с разными темпами старения отличались по исследованным показателям. В контрольной группе продолжительность жизни крыс подгруппы 2 была на 17–85 % меньше минимальной ПЖ в подгруппе 1. При этом спустя 2 нед после трансплантации карциномы Герена, размеры опухоли у крыс подгруппы 2 были почти в 2 раза больше, чем в подгруппе 1 (табл. 3). Аналогичное соотношение отмечено и в группе с ложной операцией. У этих животных различия в продолжительности жизни оказались еще более выраженными (табл. 3). Крысы подгруппы 1 отличались максимальной продолжительностью жизни (до 64 сут), а также снижением размеров карциномы Герена в 1,9 раза по сравнению с подгруппой 2 (табл. 3). Таким образом, соотношение размеров опухоли и продолжительности жизни у животных подгрупп 1 и 2 в обеих рассматриваемых группах указывало на снижение противоопухолевой резистентности организма у крыс с повышенными темпами старения.

Иная картина наблюдалась у животных с ПСН, у которых значения рассматриваемых показателей в разных подгруппах в значительной степени «перекрывались» (табл. 3). Кроме того, в данной группе крысы подгруппы 1 отличались высокой вариабельностью размеров опухоли (CV 36 %), таблица 3/table 3

размеры карциномы Герена через 2 нед после трансплантации опухоли и продолжительность жизни у крыс исследованных групп с разными темпами старения the size of guerin's carcinoma 2 weeks after tumor transplantation and lifespan in rats of the studied groups with different aging rates

Размеры опухоли через 2 нед			Продолжительность жизни после
Группы/ Groups	Подгруппы/ Subgroups	после ее трансплантации	трансплантации опухоли
		Tumor size 2 weeks after transplantation ± m, см3            CV	(диапазон значений), сут/ Lifespan after tumor transplantation,
			(range of values), days

Контроль/	1 (n=3)	13,7 ± 1,7 *	17 %	37–38* (1)
Control	2 (n=3)	27,0 ± 1,4	7 %	20–32▲ (12)
Ложная операция/	1 (n=3)	13,3 ± 0,9T *	9 %	53–64*▲ (11)
False operation	2 (n=4)	25,2 ± 5,8	40 %	20–39 (19)
ПСН/	1 (n=9)	23,0 ± 2,9	36 %	23–56 (33)
SNL	2 (n=7)	24,6 ± 3,0	30 %	33–48 (15)

Примечания: ПСН – перевязка седалищного нерва; CV – коэффициент вариации; * – отличается от значений в подгруппе 2 той же группы, p<0,05; T* – отличается от значений в подгруппе 2 той же группы (p<0,1; тенденция); ▲ – отличается от значений в подгруппе 2 группы ПСН (p<0,05, критерий Вилкоксона–Манна–Уитни).

Notes: SNL – sciatic nerve ligation; CV – the coefficient of variation; * – it differs from the values in subgroup 2 of the same group (p<0.05);

T* – it differs from the values in subgroup 2 of the same group (p<0.1; statistical trend); ▲ – it differs from the values in subgroup 2 of the SNL group (p<0.05, Wilcoxon-Mann-Whitney test).

тогда как у животных контрольной группы и крыс, подвергнутых ложной операции, в подгруппах 1 вариабельность размеров опухолей была соответственно средней (CV 17 %) и слабой (CV 9 %). Диапазон значений продолжительности жизни животных с ПСН подгруппы 1 (33 дня) в 3 раза и более превышал соответствующие показатели у крыс с ложной операцией (11 дней) и животных контрольной группы (1 день) (табл. 3). Более того, если в группе с ложной операцией продолжительность жизни, превышавшая максимальный показатель в контрольной группе, была характерна только для крыс подгруппы 1, то в группе с ПСН такие животные были отмечены также и в подгруппе 2. Кроме того, одно из двух животных группы с ПСН, у которых было отмечено временное торможение роста опухоли, относилось к подгруппе 2. Очевидно, такие различия между контрольными группами и группой с ПСН могли быть обусловлены формированием болевого синдрома, выраженность которого определялась индивидуальной чувствительностью крыс. Следует также заметить, что в рассматриваемой группе не было отмечено прямой зависимости развития опухоли и продолжительности жизни животных от степени снижения двигательной активности через 4 нед после ПСН. В частности, две крысы, у которых наблюдалось торможение роста карциномы Герена, весьма значительно различались по выраженности снижения данного показателя, кратность которого в этих двух случаях составляла соответственно 2 раза и более 6 раз.

Таким образом, изменения в организме животных с ПСН определялись комбинированным влиянием болевого воздействия, опухолевого роста и особенностями нейроэндокринной и иммунной регуляции, включавшей звенья, определяющие скорость процессов старения. При этом у отдельных животных ограниченное болевое воздействие могло способствовать активизации системных механизмов противоопухолевой резистентности за счет развития антистрессорных АР [4, 5]. Однако в большинстве случаев, как и в группе с ложной операцией, это приводило не к ингибированию роста