Влияние органических поллютантов на антиоксидантный статус элодеи

Проблема адаптации живых организмов к поллютантам различной химической природы является одной из важнейших проблем современной биологии в связи с неуклонным ростом антропогенных нагрузок на наземные и водные экосистемы. Среди органических поллютантов особое место занимают мочевина и фенольные соединения. Наибольшему воздействию подвержены водные экосистемы, поскольку значительные количества этих загрязняющих веществ поступают с хозяйственно-бытовыми и промышленными сточными водами, с коллекторными водами и ливневыми осадками.

Мочевина (карбамид), благодаря своей доступности и распространенности, может служить добавочным источником азота и органического углерода в гидроценозах. Это особенно важно для погруженных водных растений, обитающих в толще воды при пониженной освещенности и относительно низкой концентрации неорганического углерода [2]. В то же время избыточные количества мочевины могут влиять как на отдельные виды гидрофитов, так и на целые растительные сообщества. Высокие концентрации мочевины вызывают физиологические расстройства и приводят к снижению продуктивности у высших растений [8]. Продукт ее распада (аммиак), особенно при залповом загрязнении воды исследуемым амидом, может существенно влиять на качество воды, а также вызывать смену доминирующих видов в растительных сообществах [1, 7].

Фенольные соединения (ФС) в природных водах обычно находятся в растворенном состоянии в виде фенолятов, фенолят-ионов и свободных фенолов. Они могут вступать в реакции конденсации и полимеризации, образуя сложные структуры. К числу наиболее распространенных фенольных компонентов сточных вод относятся фенол, пирокатехин, гидрохинон и гваякол [11]. Техногенные фенолы, попадающие в водоемы и водотоки, вовлекаются в естественный круговорот веществ подобно природным фенолам.

Однако в большинстве случаев сброс сточных вод, содержащих ФС, в водотоки и водоемы ухудшает их общее санитарное состояние, оказывая влияние на живые организмы не только за счет токсичности фенолов, но и в результате существенного изменения режима биогенных веществ и растворенных газов [6].

Водные растения, адаптируясь к изменяющимся условиям среды, в ходе эволюции выработали защитные механизмы, препятствующие проникновению поллютантов в клетку, либо обеспечивающие их внутриклеточную детоксикацию. Анализ отечественной и зарубежной литературы свидетельствует о том, что механизмы устойчивости высших растений к мочевине и фенольным соединениям исследованы недостаточно. О способности этих поллютантов вызывать окислительный стресс практически ничего не известно.

Цель работы – оценить степень окислительного повреждения растений (на примере элодеи) при действии разных доз мочевины и фенольных соединений и исследовать влияние органических поллютантов на антиоксидантную активность листьев элодеи.

Изучение ответных реакций гидрофитов на загрязнение среды органическими поллютантами необходимо для понимания их роли в процессах самоочищения водных объектов, для разработки научно обоснованных методов интенсификации фитореме-диационных технологий и прогнозирования трансформации этих поллютантов в водных экосистемах.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования проведены в модельных системах. В качестве объекта исследований использовали элодею: Elodea densa Planch. (элодея густолиственная) и Elodea canadensis L. (элодея канадская).

Для выявления действия мочевины на показатели антиоксидантного статуса побеги элодеи (длиной 610 см) инкубировали в течение 5 суток на 5% среде Хогланда-Арнона I с добавлением возрастающих концентраций мочевины: 0 (контроль); 100; 500; 1000 мг/л при естественном освещении. Для оценки влияния монофенола побеги элодеи инкубировали в течение 4 суток на дистиллированной воде с добавлением монофенола в градиенте концентраций: 0 (контроль); 0,1; 1,0; 10 мг/л. Для выявления действия на антиоксидантную активность элодеи разных видов фенольных соединений растения в течение 2 суток инкубировали на среде с добавлением монофенола, гидрохинона, пирокатехина и резорцина (в концентрации 1 мг/л).

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активность антиоксидантных ферментов определяли в усредненных пробах листьев, которые гомогенизировали на льду в 0,1 М K/Na-фосфатном буфере (pH=7,4). Определение интенсивности ПОЛ проводили в бутанольном экстракте, по содержанию малонового диальдегида (МДА) как основного продукта липопероксидации, реагирующего с тиобарбитуровой кислотой [17]. Активность гваяколспецифичной пероксидазы (ГП) оценивали по увеличению оптической плотности реакционной среды при 470 нм в результате окисления гваякола [11]. Активность аскорбатпероксидазы (АП) измеряли с помощью модифицированного метода Nakano, Asada [15]. Активность полифенолоксидазы (ПФО) определяли титриметрическим методом с использованием аскорбиновой кислоты [9] . Определение аскорбиновой кислоты, содержание флавоноидов и общее содержание водорастворимых антиоксидантов в листьях растений определяли спектрофотометрическими методами [13, 10].

Статистическую обработку проводили в прикладных программах Excel 7.0 и Statistica 6.0. Усредненную пробу листьев каждого вида отбирали не менее чем с 10–30 растений. Число биологических повторностей для каждого определения – 3, аналитических – 3–4. Для проверки достоверности полученных результатов использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Под действием различных стрессоров в клетках живых организмов возникает окислительный стресс. Защиту от этого стресса обеспечивает антиоксидантная система, состоящая из различных компонентов, включая ферменты-антиоксиданты и низкомолекулярные антиоксиданты. Как правило, более высокая антиоксидантная активность клеток коррелирует с более высокой устойчивостью к стрессу [3].

Одной из универсальных реакций на изменение условий обитания, включая загрязнение, является индукция свободнорадикальных процессов и, в частности, перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Исследования показали, что мочевина, уже при низкой концентрации в среде (100 мг/л), вызывала окислительный стресс в листьях элодеи из-за образования повышенного количества активных форм кислорода (АФК), о чем свидетельствовала активация ПОЛ (табл. 1). Обнаружена прямая корреляция между концентрацией мочевины и содержанием МДА в листьях элодеи (r=0,98, n=12, p<0,001). Мочевина в концентрации 1000 мг/л приводила к увеличению продуктов ПОЛ более чем в 2 раза.

Таблица 1 . Влияние возрастающих концентраций мочевины на содержание МДА, аскорбата, активность аскорбат- и гваяколовой пероксидаз (АП и ГП) в листьях элодеи

Концентрация мочевины, мг/л	МДА, мкмоль/г сухой массы	Аскорбат, мг/г сухой массы	АП, ммоль/(мг белка мин)	ГП, ммоль/(мг белка мин)
0	122,24 ± 2,49 а*	2,60 ± 0,03 a	0,69 ± 0,04 a	0,66 ± 0,01 a
100	173,42 ± 6,67 b	3,51 ± 0,05 b	0,83 ± 0,04 b	0,72 ± 0,05 ab
500	225,17 ± 8,13 c	1,56 ± 0,01 c	0,68 ± 0,04 ac	1,30 ± 0,09 c
1000	248,29 ± 5,87 d	0,98 ± 0,01 d	0,36 ± 0,01 d	1,31 ± 0,04 cd

* Разными буквами отмечены достоверно различающиеся данные ( p < 0,05).

Обнаружено, что при низкой концентрации мочевины (100 мг/л) происходил усиленный синтез аскорбата в листьях элодеи. Количество аскорбиновой кислоты увеличивалось на 35% от контроля. Однако при возрастании концентрации мочевины в 5 раз (до 500 мг/л), количество аскорбата снижалось на 40% от контроля. Дальнейшее возрастание концентрации мочевины в среде (до 1000 мг/л) приводило к еще большему окислению этого антиоксиданта (на 60% от контроля).

Обнаружена высокая корреляция между содержанием аскорбата в листьях элодеи и активностью аскорбатпероксидазы (r=0,90; n=12; p<0,001). Активность этого фермента повышалась лишь при низкой концентрации мочевины (на 20% от контроля). Высокая концентрация поллютанта (1000 мг/л) угнетала активность аскорбатпероксидазы на 48%. Известно, что при участии аскорбатпероксидазы окисляется аскорбиновая кислота и при этом восстанавливается перекись водорода [16]. Вероятно, при высоких концентрациях мочевины происходит истощение пула восстановленного аскорбата, что приводит к уменьшению активности этого фермента.

Исследования показали значительное увеличение активности ГП при действии повышенных концентраций мочевины (в 2 раза по сравнению с контролем). Особенность ГП заключается в том, что она восстанавливает пероксид водорода за счет окисления фенольных соединений. Этот факт позволяет рассматривать ГП с двух позиций: как фермент, принимающий участие в окислении органических ксенобиотиков, в том числе фенолов, так и как фермент-антиоксидант, ликвидирующий пероксиды [5].

Детоксикация поллютантов фенольной природы происходит также благодаря деятельности полифено-локсидазы (ПФО), или дифенолоксидазы.

При исследовании эффектов действия монофенола в градиенте концентрации показано, что активность ГП и ПФО при добавлении в среду монофенола уменьшалась по сравнению с контролем (табл. 2). Наиболее значительное снижение наблюдалось при концентрациях 0,1 и 1,0 мг/л. Содержание водорастворимых антиоксидантов при возрастании концентрации монофенола уменьшалось, что, очевидно, мо- жет быть обусловлено их расходованием на обезвре живание активных форм кислорода.

Таблица 2 . Влияние возрастающих концентраций монофенола на активность гваяколовой пероксидазы (ГП), полифенолок-сидазы (ПФО) и содержание водорастворимых антиоксидантов в листьях элодеи

Концентрация монофенола, мг/л	ГП, мкМ/(г сухой массы мин)	ПФО, мкМ/(г сухой массы мин)	Водорастворимые антиоксиданты, мг/г сухой массы
0	0,42±0,03 а*	205,1±0,0 а	3,99±0,46 а
0,1	0,22±0,01 b	102,2±0,2 b	2,67±0,73 b
1,0	0,23±0,02 Ьс	117,2±16,9 Ьс	2,60±0,52 Ьс
10,0	0,39±0,01 d	166,0±19,5 d	2,53±0,13 d

* Разными буквами отмечены достоверно различающиеся данные (р < 0,05).

К настоящему времени механизмы действия экзогенных ФС на функционирование растений и их вторичный метаболизм изучены слабо. В связи с этим были проведены исследования, нацеленные на выявление эффектов влияния различных ФС на некоторые биохимические показатели.

Установлено, что все экзогенные фенольные со- единения в концентрации 1 мг/л оказывали токсическое действие на элодею, что привело к снижению активности ПФО в ее листьях по сравнению с контролем (табл. 3). Однако степень токсичности исследованных фенольных соединений различалась, что можно объяснить их физико-химическими особенностями.

Таблица 3 . Содержание МДА, флавоноидов и активность полифенолоксидазы (ПФО) в листьях элодеи при инкубировании в среде с различными фенольными соединениями

Вариант опыта	МДА, мкмоль/г сухой массы	Флавоноиды, мг/г сухой массы	ПФО, мкМ/(г сухой массы мин)
Контроль	370±20 а*	6,7±0,5 а	224,5±17,7 а
Монофенол, 1 мг/л	380±40 аb	5,5±0,4 b	164,8±11,9 b
Гидрохинон, 1 мг/л	360±20 аЬс	8,8±1,3 с	140,3±6,1 с
Пирокатехин, 1 мг/л	260±20 d	4,2±0,3 d	100,8±0,0 d
Резорцин, 1 мг/л	300±20 e	5,1±0,4 be	99,2±4,7 de

*Разными буквами отмечены достоверно различающиеся данные ( р < 0,05).

Фенольные соединения неоднозначно влияли на интенсивность пероксидации липидов. Как показали исследования, наименьшее содержание МДА было обнаружено в листьях элодеи, инкубированной с пирокатехином. Снижение интенсивности ПОЛ по сравнению с контролем на 30% при действии пирокатехина свидетельствует либо об очень сильной активации антиоксидантной защиты, либо, что наиболее вероятно, уже о частичном разрушении МДА под действием токсиканта, в результате чего продукты липоперокси-дации были обнаружены в меньшем количестве. Это говорит о высокой токсичности пирокатехина для данного растения.

Содержание флавоноидов в листьях элодеи за двое суток инкубирования в вариантах с пирокатехином, резорцином и фенолом понизилось на 38; 23 и 24% соответственно, в варианте с гидрохиноном - возросло на 32% по сравнению с контролем.

Такое поведение флавоноидов можно объяснить, исходя из физико-химических особенностей исследованных ФС. Известно, что пирокатехин обладает слабой летучестью, вследствие чего его элиминация из среды инкубирования выражена значительно слабее, чем у монофенола. Кроме того, пирокатехин способен образовывать активные промежуточные продукты окисления, в частности, бензохиноны, которые обладают несопоставимо более высокой реакционной способностью, чем соответствующие им фенольные соединения [6].

Физико-химические свойства гидрохинона сходны с некоторыми свойствами резорцина, однако, судя по увеличению содержания флавоноидов в листьях растений, гидрохинон является менее токсичным для растений по сравнению с другими исследованными фенольными соединениями.

Наибольшее снижение активности ПФО в листьях элодеи происходило под влиянием пирокатехина и резорцина (на 55% и 56% соответственно), наименьшее - при добавлении монофенола и гидрохинона (на 27% и 37% соответственно). Известно, что монофенол является летучим соединением и очень легко подвергается биохимическому окислению. Очевидно, что на 2-е сутки инкубирования значительная часть монофенола была элиминирована из водной среды, поэтому его фактическая концентрация в среде была существенно ниже 1 мг/л.

Как было уже отмечено, в листьях элодеи, инкубированной с резорцином, активность ПФО снижалась на 56%, а интенсивность ПОЛ - почти на 20% (табл. 3). Следовательно, резорцин оказывал не менее токсичное действие на элодею, чем пирокатехин. Известно, что резорцин не подвергается окислению по-лифенолоксидазой, т.е. токсическое действие резорцина не связано с образованием хинонов. Имеются данные [4], что некоторые фенольные соединения токсичны для растений из-за повышенных электроноакцепторных свойств в связи с их способностью обра -зовывать хелатные комплексы и выступать в роли де- натурирующих агентов или биологических депрессантов. По-видимому, в некоторых случаях фитотоксичность фенольных соединений может отражать суммарный эффект, который определяется одновременно различными свойствами молекулы.

Установлено, что мочевина, несмотря на относительно низкую токсичность и важную роль в качестве дополнительного источника азота, может представлять угрозу для растений при повышенных концентрациях так же, как и ФС. Высокие концентрации мочевины приводят к истощению пула низкомолекулярных антиоксидантов. При этом антиоксидантный статус растений поддерживается за счет высокой активности некоторых ферментов-антиоксидантов, например, гваяколовых пероксидаз.

Изучение токсичности разных ФС по их влиянию на интенсивность пероксидации и содержание флавоноидов, а также активность полифенолоксидазы в листьях элодеи показало, что наименее токсичным из исследованных фенолов является гидрохинон.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что такие органические поллютанты, как мочевина и фенольные соединения, могут оказывать повреждающий эффект на растения как непосредственно, так и опосредованно, провоцируя образование АФК и развитие окислительного стресса. Важную роль при этом играют низкомолекулярные и высокомолекулярные компоненты антиоксидантной системы защиты, активация которых обеспечивает устойчивость растений к стрессовым факторам.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.А18.21.0203 «Молекулярно-генетические и морфофизиологические подходы к оценке разнообразия и устойчивости биологических систем» и частичной финансовой поддержке молодых ученых УрФУ в рамках реализации «Программы развития УрФУ», договор № 2.1.2.1./29.