Влияние органических растворителей на экспрессию генов адаптации к стрессу в клетках Escherichia coli

Автор: Ахова А.В., Ткаченко А.Г.

Журнал: Вестник Пермского университета. Серия: Биология @vestnik-psu-bio

Статья в выпуске: 3, 2018 года.

Бесплатный доступ

С использованием генных слияний на основе репортерного гена lacZ изучено влияние метанола и диметилсульфоксида на экспрессию генов, участвующих в адаптации E. coli к различным неблагоприятным внешним воздействиям. Установлено, что добавка 5%-ного диметилсульфоксида вызывает увеличение уровня экспрессии генов sodA, fpr, rmf, cadA и снижение уровня экспрессии генов mar, ompF, rpoS, ldcC и не оказывает влияния на экспрессию soxS, micF, nfo, oxyR и katG. Из числа вышеназванных генов при добавке 5%-ного метанола наблюдалось увеличение экспрессии soxS, sodA, fpr, katG, rmf и снижение экспрессии ldcC, mar, ompF. Повышение уровня экспрессии генов антиоксидантной защиты (soxS, sodA, fpr, katG) на первых этапах воздействия растворителей может свидетельствовать о развитии окислительного стресса в бактериальных клетках. Двукратное снижение экспрессии генов, кодирующих транскрипционные регуляторы, под контролем которых находятся общие адаптивные ответы на стресс (rpoS) и действие антибиотиков (mar), в присутствии диметилсульфоксида может рассматриваться как одна из причин антибактериального действия данного соединения.

Еще

Экспрессия генов, окислительный стресс, дмсо, лизиндекарбоксилаза

Короткий адрес: https://sciup.org/147227028

IDR: 147227028

Текст научной статьи Влияние органических растворителей на экспрессию генов адаптации к стрессу в клетках Escherichia coli

галактопиранозид (электрохимический анализ) или соединения на основе 1,2-диоксетана (хемилюминесцентный анализ) [Yagi, 2007].

Генные слияния на основе репортерного гена lacZ и промоторной области генов, кодирующих адаптивные белки, нашли применение в исследовании физиологического ответа бактериальных клеток на воздействие различных стрессовых факторов. В частности, при исследовании ответа E. coli на окислительный стресс используют гены, входящие в SoxRS-регулон и OxyR-регулон [Gonzalez-Flecha, Demple, 1997; Hidalgo et al., 1998; Martin et al., 2000]. Для оценки общего стрессового ответа применяют конструкции на основе гена rpoS , который кодирует сигма S-субъединицу РНК-полимеразы – основной транскрипционный регулятор в стрессовых условиях [Lange, Hengge-Aronis, 1994]. Повреждение ДНК регистрируют с помощью изменения экспрессии генов SOS-системы репарации ДНК, в частности, индукции recA::lacZ [Kim, Oh, 2000].

Микроорганизмы, несущие репортерные конструкции на основе lacZ, используют для создания биосенсоров и тест-систем. Такие биосенсоры применяют для детекции различных соединений в окружающей среде, например меди, ртути, солей мышьяка и сурьмы [Lehmann et al., 2000; Biran et al., 2003; Stocker et al., 2003; Ng et al., 2012]. Мик- роорганизмы, несущие генные слияния на основе генов SOS-системы репарации ДНК, нашли применение в изучении генотоксичности веществ [Quillardet, Huisman, 1982; Biran et al., 2010]. Тест-системы на основе генно-модифицированных микроорганизмов используют для высокопродуктивного скрининга при поиске веществ, обладающих определенными свойствами, в том числе при разработке лекарственных препаратов [Park et al., 2010; Seyedsayamdost, 2014; van Rensburg et al., 2015].

В данной работе c использованием технологии репортерных генных слияний исследовано влияние растворителей на экспрессию генов, участвующих в адаптации E. coli к различным неблагоприятным внешним воздействиям. Полученные результаты интересны с точки зрения изучения физиологического ответа E. coli на действие растворителей, а также могут быть полезны при выборе конкретного растворителя при исследовании свойств гидрофобных веществ с использованием репортерных конструкций на основе lacZ .

Объекты и методы исследования

Использованные в данной работе штаммы Escherichia coli с указанием их генотипических свойств перечислены в табл. 1.

Таблица 1

Штаммы E. coli , использованные в работе

Штамм E. coli	Генотип	Источник
EH40	GC4468 ( soxS::lacZ )	B. Demple [Hidalgo et al., 1998]
N9086	GC4468 ( sodA::lacZ )	R. Martin [Martin et al., 2000]
N9210	GC4468 ( fpr::lacZ )	R. Martin [Martin et al., 2000]
N9212	GC4468 ( micF::lacZ )	R. Martin [Martin et al., 2000]
N9213	GC4468 ( nfo::lacZ )	R. Martin [Martin et al., 2000]
SHT45	GC4468 ( cadA::lacZ )	Лабораторная коллекция
BGF940	MC4100 ( oxyR::lacZ )	B. Demple [Gonzalez-Flecha, Demple, 1997]
BGF931	RK4936 ( katG::lacZ )	B. Demple [Gonzalez-Flecha, Demple, 1997]
RO91	MC4100 ( rpoS742’::lacZ [hybr])	R. Hengge [Lange, Hengge-Aronis, 1994]
SHT36	GC4468 ( ldcC::lacZ )	Лабораторная коллекция [Шумков и др., 2010]
N8795	GC4468 ( mar::lacZ )	R. Martin [Martin et al., 2000]
KE 6	BW25141 ( rmf::lacZ )	Лабораторная коллекция
MH513	MC4100 ( ompF::lacZ )	T. Silhavy [Hall, Silhavy, 1981]

Клетки E. coli, сохраняемые на скошенном агаре Luria-Bertani (LB), переносили в 5 мл LB бульона и культивировали 14–16 ч. при 37°С без перемешивания. Затем бактериальные клетки переносили на 5 мл свежего LB бульона в соотношении 1:11 и культивировали 1 ч. в описанных выше условиях. Полученную бактериальную культуру переносили в лунки 96-луночных микропланшетов и добавляли метанол/диметилсульфоксид/LB бульон в конечной концентрации 5% по объему (общий объем в лунке составлял 200 мкл). Дальнейшее культивирование проводили при 37°С без перемешивания. Отбор проб для определения оптической плотности культуры и активности β-галактозидазы осуществляли через 1, 2 и 4 ч. после начала воздействия растворителя.

Оптическую плотность культуры (А600) измеряли с использованием мультимодального планшетного ридера (Tecan, Швейцария).

Активность β-галактозидазы измеряли в клет- ках, предварительно обработанных смесью додецилсульфата натрия и хлороформа, методом Миллера [Miller, 1992].

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ Statistica 5.0 (StatSoft Inc., 2001). В таблицах приведены данные отдельных однотипных экспериментов (не менее трех), представленные в формате среднее ± среднее квадратичное отклонение. Оценка статистической значимости различий средних произведена с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р ≤0.05.

Результаты и их обсуждение

Исследовано влияние растворителей на экспрессию генов общего стрессового ответа и адаптации к стационарной фазе роста (rpoS, rmf), регуляции проницаемости клеточной стенки (micF, ompF), множественной антибиотикоустойчивости (mar), адаптивного ответа E. coli на пероксидный окислительный стресс (katG, oxyR) и окислительный стресс, вызванный действием редокс-циклирующих агентов (soxS, sodA, fpr, nfo). Кроме того, изучено изменение экспрессии генов, кодирующих ферменты синтеза кадаверина – лизиндекарбоксилазы (cadA, ldcC) (табл. 2). Метанол и диметилсульфоксид (ДМСО) обладают антибактериальным действием, поэтому в качестве рабочей концентрации растворителя была выбрана его максимальная концентрация, не вызывающая гибель бактериальных клеток (5% по объему). Жизнеспособность бактериальных клеток оценивали по количеству колониеобразующих единиц при высевах на твердую питательную среду. Добавка растворителя в данной концентрации приводила к снижению скорости роста некоторых штаммов E. coli. Замедление скорости роста в присутствии ДМСО составляло не более 20%, а метанола – не более 30%, по сравнению с контрольной культурой (табл. 2).

Таблица 2

Влияние растворителей на экспрессию генов и оптическую плотность E. coli

Штамм E. coli	Активность бета-галактозидазы, единицы Миллера			А600
(ген)	Контроль	ДМСО, 5%	Метанол, 5%	Контроль	ДМСО, 5%п Метанол, 5%
	(1 час)
EH40 ( soxS )	115.3±15.5	117.5±25.3	159.5±26.7	0.129±0.008	0.110±0.001	0.117±0.005
N9086 ( sodA )	434.0±73.8	558.1±43.8	872.6±32.5	0.143±0.009	0.120±0.006	0.118±0.007
N9210 ( fpr )	160.5±4.9	183.0±13.0	184.9±17.5	0.139±0.015	0.119±0.010	0.119±0.004
N9212 ( micF )	61.1±10.3	70.5±12.3	70.2±7.5	0.139±0.014	0.116±0.011	0.118±0.003
N9213 ( nfo )	408.5±62.2	391.4±68.1	419.5±59.9	0.133±0.015	0.113±0.012	0.114±0.001
SHT45 ( cadA )	78.5±11.7	81.6±9.5	79.9±4.8	0.123±0.014	0.111±0.013	0.116±0.007
BGF940 ( oxyR)	120.3±25.9	108.4±3.5	103.6±11.1	0.126±0.011	0.112±0.008	0.117±0.002
BGF931 ( katG )	108.6±5.3	115.8±9.5	144.0±17.0	0.151±0.015	0.121±0.009	0.130±0.011
RO91 ( rpoS )	85.7±8.1	88.2±9.9	89.0±6.8	0.142±0.022	0.123±0.013	0.122±0.001
SHT36 ( ldcC )	97.0±4.3	90.4±14.9	100.2±7.5	0.137±0.020	0.136±0.012	0.125±0.004
N8795 ( mar )	1052.4±137.0	606.6±135.7	767.2±169.4	0.133±0.016	0.115±0.008	0.116±0.004
KE 6 ( rmf )	729.8±6.8	910.8±13.0	860.3±13.8	0.143±0.001	0.126±0.001	0.137±0.001
MH513 ( ompF )	546.5±29.8	547.1±14.6	474.8±38.7	0.169±0.004	0.147±0.002	0.153±0.005
	(2 часа)
EH40 ( soxS )	136.1±31.2	131.8±25.4	168.8±31.9	0.161±0.030	0.149±0.013	0.148±0.019
N9086 ( sodA )	532.3±108.7	556.4±110.6	573.2±103.0	0.206±0.014	0.175±0.006	0.185±0.005
N9210 ( fpr )	248.6±38.7	265.7±26.2	252.4±27.6	0.212±0.009	0.176±0.006	0.176±0.013
N9212 ( micF )	51.3±5.2	48.5±8.3	52.8±6.6	0.207±0.008	0.168±0.009	0.171±0.004
N9213 ( nfo )	440.7±69.6	397.5±59.0	394.5±60.7	0.203±0.013	0.172±0.014	0.166±0.003
SHT45 ( cadA )	219.5±45.3	265.8±17.9	181.2±9.4	0.178±0.016	0.157±0.017	0.160±0.007
BGF940 ( oxyR )	125.9±19.4	108.6±13.5	102.0±7.6	0.179±0.001	0.155±0.005	0.165±0.012
BGF931 ( katG )	106.3±13.4	125.6±37.8	158.9±61.5	0.201±0.010	0.178±0.008	0.174±0.003
RO91 ( rpoS )	319.0±77.0	122.6±26.9	267.3±61.5	0.220±0.023	0.185±0.018	0.190±0.014
SHT36 ( ldcC )	194.2±50.3	143.0±16.8	140.9±6.6	0.206±0.014	0.174±0.009	0.172±0.003
N8795 ( mar )	798.6±197.8	398.8±38.4	556.8±28.8	0.205±0.014	0.171±0.011	0.165±0.001
KE 6 ( rmf )	2505.2±33.9	3101.7±49.7	3098.4±37.7	0.209±0.006	0.182±0.006	0.177±0.001
MH513 ( ompF )	869.3±53.6	670.2±12.5	637.5±85.2	0.224±0.006	0.200±0.002	0.197±0.003

Окончание табл. 2

Штамм E. coli (ген)	Активность бета-галактозидазы, единицы Миллера			А600
Штамм E. coli (ген)	Контроль	ДМСО, 5%	Метанол, 5%	Контроль	ДМСО, 5%	Метанол, 5%
	(4 часа)
EH40 ( soxS )	109.9±8.0	85.5±10.4	111.1±6.3	0.214±0.053	0.227±0.051	0.180±0.023
N9086 ( sodA )	299.9±48.9	301.7±74.4	255.0±26.8	0.294±0.014	0.287±0.015	0.231±0.032
N9210 ( fpr )	166.5±25.4	197.3±50.8	184.8±14.4	0.296±0.028	0.264±0.037	0.218±0.022
N9212 ( micF )	30.3±8.2	28.5±1.5	30.5±6.9	0.289±0.017	0.255±0.018	0.220±0.022
N9213 ( nfo )	283.8±59.2	255.9±63.5	284.7±7.0	0.301±0.024	0.269±0.029	0.211±0.017
SHT45 ( cadA )	106.9±16.6	194.6±47.8	153.0±36.9	0.276±0.018	0.239±0.020	0.198±0.024
BGF940 ( oxyR )	79.1±12.2	69.8±14.0	86.6±26.3	0.235±0.032	0.213±0.027	0.198±0.054
BGF931 ( katG )	62.3±9.6	57.8±10.2	75.2±15.4	0.288±0.025	0.280±0.053	0.194±0.028
RO91 ( rpoS )	213.6±30.6	125.3±12.7	220.4±16.7	0.318±0.016	0.278±0.015	0.268±0.006
SHT36 ( ldcC )	140.9±17.4	101.4±29.1	111.4±15.5	0.279±0.026	0.249±0.049	0.184±0.031
N8795 ( mar )	446.4±49.6	215.8±42.7	381.9±9.04	0.282±0.023	0.241±0.040	0.208±0.029
KE 6 ( rmf )	4277.0±157.5	8130.6±314.3	6166.3±300.5	0.268±0.009	0.230±0.002	0.222±0.014
MH513( ompF )	980.3±118.7	860.8±27.3	617.3±18.5	0.301±0.010	0.299±0.002	0.280±0.034

Значения, статистически значимо отличающиеся от контрольных значений, выделены полужирным курсивом ..

В присутствии ДМСО наблюдалось увеличение экспрессии генов sodA , fpr , rmf , cadA и снижение экспрессии генов mar , rpoS , ompF , ldcC . Повышение уровня экспрессии антиоксидантных генов на начальных этапах воздействия растворителя (1 ч.) и изменение экспрессии генов синтеза кадаверина на завершающем этапе наблюдения при переходе культуры в стационарную фазу роста (4 ч.) имело временный характер. В свою очередь, стимулирующий эффект растворителя на ген rmf , так же как и его ингибирующее действие на mar и rpoS отмечались на протяжении всего времени наблюдения. Изменение уровня экспрессии этих трех генов было в среднем двукратным.

На первых этапах воздействия метанола, так же как и в случае добавки ДМСО, наблюдалась активация генов антиоксидантной защиты ( soxS , sodA , fpr , katG ). Метанол вызывал увеличение экспрессии более широкого спектра антиоксидантых генов, при этом его стимулирующий эффект был выше в сравнении с ДМСО. Например, экспрессия гена sodA , кодирующего супероксиддисмутазу, нейтрализующую супероксидные радикалы, увеличивалась на 29% при добавке ДМСО и в 2 раза в условиях воздействия метанола. Активация экспрессии гена katG , кодирующего каталазу, нейтрализующую перекись водорода, наблюдалась только в клетках, подвергнутых действию метанола. Аналогично ДМСО, добавка метанола приводила к увеличению экспрессии rmf в бактериальных клетках. Ингибирующее действие метанола наблюдалось лишь при переходе бактериальной культуры в стационарную фазу роста и было направлено на экспрессию генов ldcC , mar и ompF . Под действием метанола уровень экспрессии вышеуказанных генов снижался по сравнению с контролем на 21, 14 и 37%, соответственно.

Изменение профиля экспрессии генов E. coli свидетельствует об активации адаптивного ответа на окислительный стресс на начальном этапе воздействия исследованных растворителей, в особенности метанола. Исходя из этого, можно предположить, что добавка ДМСО и метанола провоцирует увеличение количества активных форм кислорода и формирование окислительного стресса в бактериальных клетках.

Снижение экспрессии гена ompF , кодирующего белок, формирующий во внешней мембране пори-новый канал с высокой пропускной способностью, можно рассматривать как адаптивный ответ, направленный на ограничение проницаемости клеточной оболочки для токсических соединений. Увеличение экспрессии гена cadA почти в 2 раза в ответ на добавку ДМСО также может быть направлено на снижение проницаемости клеточной оболочки, поскольку кодируемая этим геном лизиндекарбоксилаза катализирует синтез кадаверина, для которого описан эффект ограничения транспорта веществ за счет связывания в просвете поринового канала [Samartzidou et al., 2003]. Снижение в присутствии ДМСО экспрессии гена ldcC , кодирующего вторую лизиндекарбоксилазу, наиболее вероятно, связано со снижением экспрессии гена rpoS , продукт которого является основным транскрипционным активатором ldcC [Kikuchi et al., 1997].

Выраженное ингибирующее действие ДМСО в отношении экспрессии транскрипционных регуляторов rpoS и mar может рассматриваться как одна из причин антибактериального действия данного соединения. RpoS является транскрипционным регулятором общего стрессового ответа, под контролем которого находится более 100 генов, позволяющих E. coli адаптироваться к условиям кислот- ного, осмотического, температурного и окислительного стрессов, воздействию антибиотиков и УФ-излучения [Lange, Hengge-Aronis, 1994].

Транскрипционный регулятор MarA контролирует экспрессию генов, кодирующих системы множественного лекарственного выброса, антиоксидантные ферменты и регуляторы поринового транспорта [Martin et al., 2000]. Можно предположить, что угнетение экспрессии столь важных регуляторов значительно снижает адаптивные возможности бактериальных клеток и их способность выживать в неблагоприятных условиях. В связи с этим не исключено усиление антибактериальной активности соединений, растворенных в ДМСО.

Ген rmf кодирует белок, который, связываясь с рибосомой, ингибирует процесс трансляции, что является адаптивным механизмом при замедлении скорости роста бактериальной культуры и при переходе в стационарную фазу [Yamagishi et al., 1993]. Экспрессия данного гена обратно пропорциональна скорости роста, поэтому наблюдаемое 20%-ное увеличение уровня экспрессии rmf в экспоненциальной фазе роста может быть связано с небольшим ингибированием роста культуры под действием растворителей. В стационарной фазе роста уровень экспрессии rmf повышается на 40% в ответ на добавку метанола, и увеличивается почти в 2 раза в присутствии ДМСО, в то время как рост бактериальной культуры при добавке растворителей замедляется примерно одинаково, на 17 и 14%, соответственно. Поэтому можно предположить наличие особых механизмов регуляции экспрессии rmf в ответ на действие ДМСО.

Таким образом, метанол и ДМСО вызывают изменение экспрессии некоторых генов E. coli , что стоит учитывать при выборе их в качестве растворителя при изучении биологической активности соединений. Добавка метанола и, в меньшей степени, ДМСО приводит к кратковременной активации генов антиоксидантной защиты, что может свидетельствовать о развитии окислительного стресса в клетках E. coli на первых этапах воздействия растворителей. ДМСО, в свою очередь, вызывает почти двукратное снижение уровня экспрессии генов rpoS и mar , кодирующих транскрипционные регуляторы, под контролем которых находятся общие адаптивные ответы на стресс и действие антибиотиков.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353249.

Список литературы Влияние органических растворителей на экспрессию генов адаптации к стрессу в клетках Escherichia coli

Шумков М.С. и др. Изменение экспрессии ldcC Escherichia coli как фактор адаптации к антибиотикам // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2010. Вып. 1. С. 36-40.
Biran A. et al. Bacterial genotoxicity bioreporters // Microbial Biotechnology. 2010. Vol. 3, № 4. P. 412-427.
Biran I. et al. Optical imaging fiber-based live bacterial cell array biosensor // Analytical Biochemistry. 2003. Vol. 315, № 1. P. 106-113.
Gonzalez-Flecha B.,Demple B. Transcriptional regulation of the Escherichia coli oxyR gene as a function of cell growth // Journal of bacteriology. 1997. Vol. 179, № 19. P. 6181-6.
Hidalgo E., Leautaud V., Demple B. The redox-regulated SoxR protein acts from a single DNA site as a repressor and an allosteric activator // EMBO Journal. 1998. Vol. 17, № 9. P. 2629-2636.
Kikuchi Y. et al. RpoS-dependent expression of the second lysine decarboxylase gene in Escherichia coli // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 1997. Vol. 62, № 6. P. 1267-1270.
Kim I., Oh T. SOS induction of recA by UV-, y-irradiation and mitomicin C is mediated by poly-amines in Escherichia coli K-12 // Toxicology Letters. 2000. Vol. 116. P. 143-149.
Lange R., Hengge-Aronis R. The cellular concentration of the sigma S subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability // Genes & Development. 1994. Vol. 8, № 13. P. 1600-1612.
Lehmann M. et al. Amperometric measurement of copper ions with a deputy substrate using a novel Saccharomyces cerevisiae sensor // Biosensor and Bioelectronics. 2000. Vol. 15, № 3-4. P. 211-219.
Martin R., Gillette W., Rosner J. Promoter discrimination by the related transcriptional activators MarA and SoxS: differential regulation by differential binding // Molecular Microbiology. 2000. Vol. 35, № 3. P. 623-634.
Miller J.H. Experiments in molecular genetics. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1992. 466 p.
Ng S., Palombo E., Bhave M. Identification of a copper-responsive promoter and development of a copper biosensor in the soil bacterium Achromobacter sp. AO22 // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2012. Vol. 28, № 5. P. 2221-8.
Park S., Chung H., Lee J. Rapid in vivo screening system for anti-oxidant activity using bacterial re-dox sensor strains // Journal of Applied Microbiology. 2010. Vol. 108, № 4. P. 1217-1225.
Quillardet P. et al. SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1982. Vol. 79, № 19. P. 5971-5975.
Samartzidou H. et al. Cadaverine inhibition of porin plays a role in cell survival at acidic pH // Journal of bacteriology. 2003. Vol. 185, № 1. P. 13-19.
Seyedsayamdost M. High-throughput platform for the discovery of elicitors of silent bacterial gene clusters // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2014. Vol. 111, № 20. P. 7266-7271.
Silhavy T., Beckwith J. Uses of lac fusions for the study of biological problems // Microbiological Reviews. 1985. Vol. 49, № 4. P. 398-418.
Stocker J. et al. Development of a set of simple bacterial biosensors for quantitative and rapid measurements of arsenite and arsenate in potable water // Environmental Science & Technology. 2003. Vol. 37, № 20. P. 4743-4750.
van Rensburg J. et al. Development and validation of a high-throughput cell-based screen to identify activators of a bacterial two-component signal trans-duction system // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2015. Vol. 59, № 7. P. 3789-3799.
Yagi K. Applications of whole-cell bacterial sensors in biotechnology and environmental science // Applied Microbiology and Biotechnology. 2007. Vol. 73. P. 1251-1258.
Yamagishi M. et al. Regulation of the Escherichia coli rmf gene encoding the ribosome modulation factor: growth phase- and growth rate-dependent control // EMBO Journal. 1993. Vol. 12, № 2. P. 625-630.

Еще

Статья научная