Влияние парциального давления кислорода в брюшной полости на экспрессию фактора, индуцируемого гипоксией в эксперименте (HIF-1a)

Послеоперационная спаечная болезнь брюшной полости является наиболее частым отдаленным осложнением абдоминальной и тазовой хирургии. Независимо от вида или анатомической локализации в 50–95% случаях после оперативного вмешательства возникает адгезивный процесс в брюшной полости. В отличие от других послеоперационных осложнений, таких как инфицирование и несостоятельность анастомоза, последствия спайкообразования определяют пожизненный риск непроходимости кишечника и длительное, неуклонно прогрессирующее течение заболевания [1–3].

Зачастую пациенты со спаечной болезнью наблюдаются у специалистов разного профиля, в частности: гастроэнтерологов, проктологов, терапевтов, за исключением хирурга, который делал первую операцию. Поэтому абдоминальные хирурги нередко остаются в неведении о развитии данного осложнения у своих пациентов, что объясняет существенную недооценку сложившейся ситуации. Кроме того, имеет место мнение о безуспешно- сти попыток хирургического лечения спаечной болезни брюшной полости. Пациентов информируют о том, что каждое последующее вмешательство будет лишь усугублять состояние, а оперироваться нужно только в случае развития непроходимости кишечника. Вместе с тем, обратная связь и преемственность чрезвычайно важны для принятия верных хирургических решений, своевременного распознавания осложнений и надлежащего информирования пациентов [4–6].

Выраженная хроническая абдоминальная боль, дисфорические и диспепсические явления, дисфункция органов и систем значительно снижают качество жизни пациентов, повышают вероятность повторных операций и представляют собой серьезную клиническую и экономическую проблему. При наличии спаечного процесса в брюшной полости оперативные вмешательства чреваты увеличением их длительности, кровотечением и перфорацией [7–9].

Клинические проявления послеоперационных сращений брюшной полости в последнее время изучены достаточно хорошо, однако, патофизиологические аспекты

образования и механизмы развития адгезии до настоящего времени полностью не установлены [10; 11].

Исследования последних лет указывают на то, что спайкообразование — это нерегулируемый, динамический процесс репарации ткани брюшины, характеризующийся клеточным и иммунным ответом. При этом восстановление мезотелия всегда проходит стадию воспалительной реакции поврежденных тканей и гипоксии [7; 8; 11].

Некоторые доклинические и клинические исследования доказывают, что лапароскопический доступ снижает вероятность образования послеоперационных спаек, особенно в контексте адгезиолизиса. С другой стороны, кар-боксиперитонеум повышает внутрибрюшное давление, влияющее на функцию органов и систем и приводящее к химическому повреждению субклеточных структур, включая продукцию активных форм кислорода [3; 6].

Доказано, что гипоксия тканей играет ключевую роль в формировании адгезии применительно к любым локализациям. Вместе с тем, в данный момент нет количественной оценки гипоксических изменений в тканях при спаечной болезни брюшной полости. Исследование факторов роста и фактора, индуцированного гипоксией в экспериментальных условиях в зависимости от системной и местной гипоксии при спаечной болезни брюшной полости, является недостаточно изученной проблемой фундаментальной и клинической медицины.

Таким образом, идеальной стратегии профилактики и лечения спаечной болезни брюшной полости на данный момент нет.

Материал и методы

Исследование проведено на 35 животных, которым суммарно выполнено 128 измерений методом прямой оксиметрии. Всем животным выполнялось иммуногистохимическое исследование с целью определения экспрессии фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1а). Распределение по группам отражено в таблице 1.

Оперативные вмешательства проводили лапаротом-ным доступом в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. Животных вводили в

Табл. 1. Распределение животных по группам

Название группы Кол-во животных Кол-во измерений (Cont) Контрольная группа (общая) 10 30 (O) Группа изучения влияния предложенного обогащения брюшины кислородом, из них: 15 60 (O-1) 50% кислород 5 17 (O-2) 100% углекислый газ 5 13 (O-3) воздух 5 30 (G) Группа изучения влияния газовых сред на спаечный процесс, из них: 10 38 (G-1) 50% кислород 5 21 (G-2) 10% кислород 5 17 Всего 35 128 наркоз путем внутриплеврального введения 1% раствора тиопентала натрия в дозе 70 мг на 1 кг массы тела в сочетании с внутримышечным введением 0,005% раствора фентанила — 0,5 мл.

Методика изучения влияния концентрации кислорода в брюшной полости на экспрессию фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1a) и оксигенацию париетальной брюшины (группа — O). Лабораторному животному в условиях асептики и антисептики проводили лапароцентез по срединной линии, вводили и фиксировали одиночными швами гибкую прозрачную полихлорвиниловую трубку (внутренний диаметр 3 мм, наружный диаметр 5 мм) с коннектором. В группе O-1 лабораторным животным в брюшную полость инсуфлировали газовую смесь, содержащую 50% кислород. Газовая смесь представляла собой смесь кислорода с воздухом в соотношении 1:2. Во группе O-2 животных инсуфлировали 100% углекислый газ. В группе O-3 животным в брюшную полости инсуфлировали атмосферный воздух. Давление нагнетаемой газовой смеси в брюшной полости составляло 15 мм рт. ст. Длительность воздействия составляла 4 часа. Спустя указанный промежуток времени животные выводились из эксперимента с последующим проведением оксиметрии, иммуногистохимических и морфологических исследований тканей брюшины на расстоянии 2 см от края лапаротомной раны.

Методика изучения влияния концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе на экспрессию фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1a) и оксигенацию париетальной брюшины (группа — G). В G-1 группу были включены лабораторные животные, которых помещали в гипербарическую камеру с газовой смесью содержащий 50% кислород. Газовая смесь представляла собой смесь кислорода с воздухом в соотношении 1:2. В группе G–2 животных помещали в гипербарическую камеру с газовой смесью содержащий 10% кислород. Длительность воздействия составила 8 часов со свободным доступом к воде и пище. Спустя указанный промежуток времени животные выводились из эксперимента с последующим морфологическим исследованием и оксиметрией брюшины на расстоянии 2 см от края лапаротомной раны.

Результаты и обсуждение

Анализ влияния концентрации кислорода в брюшной полости на оксигенацию париетальной брюшины и экспрессию факторов роста.

Показатели массопереноса кислорода, измеряемые в диапазонах 145–155, 30–35 мм рт. ст. и парциальное давление кислорода по результатам оксиметрии париетальной брюшины в исследуемых группах, распределились следующим образом (табл. 2).

Парциальное давление кислорода в группе (O-1) «Оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью» (Me = 43,79 мм рт. ст. (Ql = 37,13; Qu = 51,24), M = 44,35±2,8 мм рт. ст.). Данный показатель выше на 53%,

Табл. 2. Парциальное давление кислорода в брюшине

Название группы	Ме, мм рт. ст.	Ql, мм рт. ст.	Qu, мм рт. ст.
(O-1) Оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью, N = 17	43,79	37,13	51,24
(O-2) Оксигенация брюшной полости 5% кислородной смесью, N = 13	5,56	5,02	6,16
(O-3) Оксигенация брюшной полости 21% кислородной смесью, N = 30	27,15	16,40	32,70
(Cont) Контрольная группа, N = 30	28,70	19,90	34,65

Kruskal-Wallis test: H (3, N = 90) = 43,52469 p<0,0001

Табл. 3. Изменение индекса оксиметрии в брюшине

Название группы	Ме, мм рт. ст.	Ql, мм рт. ст.	Qu, мм рт. ст.
(O-1) Оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью, N = 17	6,75	6,29	7,71
(O-2) Оксигенация брюшной полости 5% кислородной смесью, N = 13	3,64	2,89	3,93
(O-3) Оксигенация брюшной полости 21% кислородной смесью, N = 30	5,62	5,30	6,22
(Cont) Контрольная группа, N = 30	6,24	5,09	6,54

Kruskal-Wallis test: H (3, N = 90) = 39,33136 p<0,0001

по сравнению с группой контроля (Me = 28,7 мм рт. ст. (Ql = 19,9; Qu = 34,65), M = 27,24±2,08 мм рт. ст.), Mann-Whitney U Test, U = 70,0, p = 0,00004. В группе (O-2) «Оксигенация брюшной полости 5% кислородной смесью» парциальное давление кислорода значимо изменятся до Me = 5,56 мм рт. ст. (Ql= 5,02; Qu = 6,16), M = 5,6±0,44 мм рт. ст., что ниже на 81%, чем в контрольной группе, Mann-Whitney U Test, U = 16,0, p = 0,0001. В группе (O-3) «Оксигенация брюшной полости 21% кислородной смесью» парциальное давление кислорода равно — Me = 27,15 мм рт. ст. (Ql = 16,4; Qu = 32,7), M = 25,82±2,32 мм рт. ст., что на 5% ниже, чем в контрольной группе, Mann-Whitney U Test, U = 406,0, p = 0,52.

Скорость массопереноса кислорода в интервале 145–155 мм рт. ст. у экспериментальных животных в группе (O-1) «Оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью» составила Me = 260,47 мм рт. ст./мин (Ql = 165,08; Qu = 276,59), M = 224,38±20,73 мм рт. ст./мин, что на 7% ниже, чем в контрольной группе Me = 243,01 мм рт. ст./мин (Ql= 210,25; Qu = 295,81), M = 252,98±9,79 мм рт. ст./мин, Mann-Whitney U Test, U = 70,0, p<0,0001. В группе (O-2) «Оксигенация брюшной полости 5% кислородной смесью» этот показатель значимо изменился до Me = 104,54 мм рт. ст./мин (Ql = 72,4; Qu = 176,64), M = 136,4±22,3 мм рт. ст./мин, увеличиваясь на 57%, по сравнению с контрольной группой, Mann-Whitney U Test, U = 51,5, p = 0,0001. В группе (O-3) «Оксигенация брюшной полости 21% кислородной смесью» скорость массопереноса равна Me = 273,67 мм рт. ст./мин (Ql = 218; Qu = 353,42), M = 285,84±14,78 мм рт. ст./мин, что ниже на 19% по сравнению с контрольной группой, Mann-Whitney U Test, U = 323, p = 0,09, таблица 3.

У экспериментальных животных в группе (O-1) «Оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью» индекс оксиметрии составил Me = 6,75 (Ql = 6,29; Qu = 7,71), M = 7,15±0,28, что выше на 8%, по сравнению с контрольной группой Me = 6,24 (Ql = 5,09; Qu = 6,54), M = 5,73±0,22, Mann-Whitney U Test, U = 108,5, p = 0,001. В группе (O-2) «Оксигенация брюшной полости 5% кислородной смесью» этот показатель значимо изменился до Me = 3,64 (Ql = 2,89; Qu = 3,93), M = 3,42±0,2 по сравнению с контрольной, при этом был ниже на 42%, Mann-Whitney U Test, U = 27,0, p<0,0001. В группе (O-3) «Оксигенация брюшной полости 21% кислородной смесью»

Табл. 4. Экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), при изменении концентрации кислорода внутри брюшной полости

Название группы Среднее арифметическое, M±SD Медиана, Ме Ql Qu (O-1) Оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью, N = 14 4,13±1,8 3,565 2,78 5,69 (O-2) Оксигенация брюшной полости 5% кислородной смесью, N = 10 26,66±13,1 23,075 16,06 35,48 (O-3) Оксигенация брюшной полости 21% кислородной смесью, N = 30 7,31±4,3 6,075 3,06 11,17 (Cont) Контрольная группа, N = 24 9,28±4,2 9,91 6,025 12,24 индекс оксиметрии равен Me = 5,62 (Ql = 5,3; Qu = 6,22), M = 5,49±0,27, то есть ниже на 10% по сравнению с контрольной группой, Mann-Whitney U Test, U = 375,0, p = 0,27.

Экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), при изменении концентрации кислорода внутри брюшной полости, значимо, p<0,001, изменялась в зависимости от концентрации кислорода, таблица 4.

Гипероксия — оксигенация брюшной полости 50% кислородной смесью, способствует уменьшению экспрессии фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), на 55,5%. При оксигенации кислорода в концентрации 5% (гипоксия), экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), возрастает на 187,3%. При нормоксии — оксигенации брюшной полости 21% кислородной смесью, экспрессия HIF-1 α значимо не отличалась от таковой в контрольной группе, рисунок 1.

Выявленные изменения свидетельствует о существенной роли газовой среды для выполнения оперативного вмешательства. Применение гипоксических условий способствует развитию гипоксии мезотелия и стимулирует развитие спаечного процесса.

Анализ влияния концентрации кислорода в выдыхаемом воздухе на оксигенацию париетальной брюшины и экспрессию факторов роста.

Показатели массопереноса кислорода, измеряемые в диапазонах 145–155 мм рт. ст., 30–35 мм рт. ст. и парциальное давление кислорода по результатам оксиметрии париетальной брюшины в группах с различной концен-

□ Median I 1 25-75% Min-Max

Рис. 1. Экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ) в различных газовых средах.

Табл. 6. Индекс оксиметрии при различных дыхательных газовых смесях

Название группы	Ме, ед	Ql, ед	Qu, ед
(G-1) 50% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе, N = 21	6,74	6,35	7,66
(G-2) 10% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе, N = 17	2,58	0,96	3,69
(Cont) Контрольная группа, N = 30	6,24	5,09	6,54

Kruskal-Wallis test: H (2, N = 68) = 33,23271 p<0,0001

Табл. 5. Парциальное давление кислорода в брюшине

Название группы	Ме, мм рт. ст.	Ql, мм рт. ст.	Qu, мм рт. ст.
(G-1) 50% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе, N = 21	39,83	34,59	52,70
(G-2) 10% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе, N = 17	4,50	2,31	6,15
(Cont) Контрольная группа, N = 30	28,70	19,90	34,65

Kruskal-Wallis test: H (2, N = 62) = 36,83158 p<0,0001

” 50 ^45,

40,

35, 30.

25,

20, 15.

0_.

G-2

C°nt Группа

□ Median

I 1 25-75%

Min-Max

трацией кислорода во выдыхаемом воздухе, распределились следующим образом (табл. 5).

Скорость утилизации кислорода в интервале 145–155 мм рт. ст. в группе (G-1) «50% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе» составила Me = 164,16 мм рт. ст./мин (Ql = 118,48; Qu = 257,5), M = 196,37±22,77 мм рт. ст./мин, что ниже на 32% по сравнению с контрольной группой (Me = 243,01 мм рт. ст./мин (Ql = 210,25; Qu = 295,81), M = 252,98±9,79 мм рт. ст./мин), Mann-Whitney U Test, U = 184,0, p = 0,01. В группе (G-2) «10% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе» этот показатель значимо изменился до Me = 150,89 мм рт. ст./мин (Ql = 102,97; Qu = 167,7), M = 151,64±14,21 мм рт. ст./мин, при этом снижалась на 38%, по сравнению с контрольной группой, Mann-Whitney U Test, U = 53,0, p<0,0001. Парциальное давление кислорода в группе (G-1) «50% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе» парциальное давление кислорода составила Me = 39,83 мм рт. ст. (Ql = 34,59; Qu = 52,7), M = 42,5±2,71 мм рт. ст, увеличиваясь на 39% по сравнению с контрольной группой Me = 28,7 мм рт. ст. (Ql = 19,9; Qu = 34,65), M = 27,24±2,08 мм рт. ст., Mann-Whitney U Test, U = 107,0, p = 0,0002 В группе (G-2) «10% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе» этот показатель значимо изменился до Me = 4,5 мм рт. ст. (Ql = 2,31; Qu = 6,15), M = 4,76±0,66 мм рт. ст., при этом снизился на 84%, по сравнению с контрольной группой, Mann-Whitney U Test, U = 12,5 p = 0,0001, таблица 6.

Рис. 2. Экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ) при изменении концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе.

В группе (G-1) «50% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе» индекс оксиметрии у экспериментальных животных составил Me = 6,74 (Q_l = 6,35; Q_u = 7,66), M = 6,53±0,53, что на 8% ниже по сравнению с контрольной группой Me = 6,24 (Q_l = 5,09; Q_u= 6,54), M = 5,73±0,22, Mann-Whitney U Test, U = 169,5, p = 0,005. В группе (G-2) «10% кислородная смесью во вдыхаемом воздухе» этот показатель значимо изменился до Me = 2,58 (Q_l = 0,96; Q_u = 3,69), снижаясь на 59%, M = 2,14±0,4, по сравнению с контрольной группой, Mann-Whitney U Test, U = 21,0, p<0,0001. При изменении концентрации кислорода во вдыхаемой смеси значимо изменялась экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), рисунок 2.

Нахождение лабораторного животного в газовой среде с 50% кислородной смесью способствует уменьшению экспрессии фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ) на 54,2%.

Иммуногистохимическая картина подтверждает представленные выводы, рисунок 3.

При гипоксии, нахождении в газовой смеси с 5% концентрацией кислорода, экспрессия фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), возрастает на 194,2%. При нормоксии — экспрессия HIF-1 α значимо не отличалась от таковой в контрольной группе.

Рис. 3. Экспрессия фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1 α ) в группе Adhesion ileus.

Выводы

На экспрессию фактора, индицируемого гипоксией (HIF-1 α ), значимо влияют гипероксия, гипоксия в брюшной полости (уменьшение на 55% и увеличение на 187% от контрольной группы соответственно), во вдыхаемом воздухе (уменьшение на 54% и увеличение на 194% от контрольной группы соответственно), воздействие фибрина (на 245%), моделированная частичная (на 278%) и полная (на 248%) кишечная непроходимость, повышение внутрибрюшного давления (на 298%), (p<0,001), способствуя спаечному процессу.

Выявленные изменения свидетельствует о существенном влиянии гипоксии на оксигенацию органов брюшной полости. Развитие гипоксии в брюшине способствует продуцированию грубоволокнистой соединительной ткани и, как следствие, адгезивному процессу в брюшной полости. Поддержание нормоксии в послеоперационном периоде у пациентов с абдоминальной патологией важнейшая задача в лечении пациентов хирургического профиля.

Разобщение патологического каскада: ранняя активизация пациентов, купирование пареза кишечника, нормоксия или гипероксия тканей брюшины в послеоперационном периоде, является одним из приоритетных направлений лечения и профилактики спаечной болезни брюшной полости.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).