Влияние питьевого поведения на содержание альфа-амилазы ротовой жидкости у студентов с предиктором воспаления и без них на фоне учебного стресса

¹ Введение. Все более пристальное внимание исследователей привлекает взаимодействие нейроэндокринной и иммунной систем, что нашло свое выражение в появлении термина «психоиммунология» [1]. Одним из связующих звеньев между автономной нервной и иммунной системами служит альфа-амилаза. Результаты исследований у человека и животных демонстрируют, что автономная нервная система принимает значимое участие в секреции альфа-амилазы ротовой жидкости (sAA) с вкладом как альфа-адренергических, так и бета-адренергических механизмов, в связи с этим sAA может рассматриваться как косвенный показатель ее активации [2]. Саливадиагностика помогает определить стресс двух типов: хронический, ассоциированный с увеличением количества кортизола в слюне и снижением IgA и лизоцима; острый, связанный с повышение активности альфа-амилазы [3]. Кроме того, в модулировании различных аспектов социального и эмоционального поведения играют роль цитокины [4]. Так, ИЛ-1β, помимо ключевой роли медиатора воспаления при периодонтите [5], тесно коррелирует с состоянием гнева [4]. Каждый из этих критериев ротовой жидкости имеет свои сильные и слабые стороны, учитывая недостаточное количество данных, имеющееся на настоящий момент [6].

Существует корреляция между уровнем кортизола слюны и активностью альфа-амилазы, в синтезе которой участвует автономная нервная система с преобладанием влияния симпатического отдела через запуск вторичных посредников, в том числе кальция [7]. Стресс-индуцированные состояния способствуют хронической активации симпатической системы и гипоталамо-гипофизарно-надпочечнико-вой оси, что ведет к развитию хронических воспалительных заболеваний, в том числе полости рта [8– 12]. В противоположность этому, физиологическая коррекция питьевого поведения, согласно данным L. Priumboom et al. [13], приводит к уменьшению активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (HPA), уменьшает стрессочувствительность, регулирует симпатическую / парасимпатическую активность [14].

Цель: изучить содержание α-амилазы в ротовой жидкости у здоровых молодых людей в зависимости от наличия предиктора воспалительных заболеваний полости рта при физиологически откорректированном питьевом поведении на фоне учебного стресса.

Задачи:

• 1.    Измерить концентрацию ИЛ-1β ротовой жидкости у здоровых молодых добровольцев.

• 2.    Определить уровень активности секреторной альфа-амилазы на фоне коррекции питьевого поведения.

• 3.    Выяснить уровень симпатикотонии участников в условиях учебного стресса.

Материал и методы. В исследовании приняли участие 85 человек обоего пола (средний возраст 18 лет) из 193 желающих. Проведено открытое, сравнительное, контролируемое в параллельных группах исследование, проходившие в три этапа: первичный сбор данных, или первый этап (20.09.2014), второй этап (08.11.2014), третий этап (20.12.2014). Сформированы три репрезентативные группы:

основная (30 человек, употребляли 30–35 мл воды на 1 кг массы тела, обработанной электромагнитным аппаратом ОАО «Аква-Система» (Москва));

плацебо-группа (30 человек, употребляли 30– 35 мл воды на 1 кг массы тела, обработанной плацебо-прибором, не имеющим внутри корпуса электромагнитного устройства);

контрольная (25 человек, не меняющих свое питьевое поведение).

Участники использовали в приборах (модель «аквадиск-кувшин») предварительно очищенную с помощью бытовых фильтров воду из централизованных источников, а также бутилированную воду. Электромагнитное воздействие устройства (согласно инструкции) приводит к преобразованию структуры воды (технология TWS — патент РФ №2192902 «Способ передачи и записи энергоинформационных потоков на вещество или комбинацию веществ»), что сокращает избыточное содержание вредных примесей: согласно заключению аналитического центра химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова (протокол №4145 от 23.04.2002), концентрация железа уменьшается в 3–5 раз, азота аммонийного в 3 раза, хлора активного и сероводорода в 2 раза html).

Критерии включения в исследование: клинически здоровые студенты-добровольцы разных полов (18– 20 лет). Критерии исключения: неконтролируемая гипертензия, сахарный диабет, заболевания сердца, легких и почек; прием медикаментов, которые влияют на аппетит или вес тела; онкологические заболевания.

Формирование групп проходило случайным способом (рандомизацией) после получения постановления о соответствии исследования этическим нормам и информированного письменного согласия от участников (протокол №124 от 10.10.2012 комитета по биоэтике при СамГМУ).

Содержание альфа-амилазы ротовой жидкости определяли колориметрическим методом на автоматизированном оборудовании Cobas C111 (Roche) и коммерческих тест-системах этой же компании. Пробы хранили при –20°С до момента исследования (не дольше двух недель), после полного размораживания их тщательно перемешивали, осадок отделяли центрифугированием 15 минут при 1500 g. В течение получаса перед началом измерений пробы находились при комнатной температуре. Далее материал разводился физиологическим раствором (в эмпирически подобранном титре 1:100).

Таблица 1

Содержание альфа-амилазы в ротовой жидкости студентов всех групп на 1–3-м этапах исследования

sAA, МЕ/л	Основная группа (1), Ме (25%; 75%)	Плацебо-группа (2), Ме (25%; 75%)	Контрольная группа (3), Ме (25%; 75%)	р, ККУ	р, КМУВ (1)-(2)	р, КМУВ (1)-(3)	р, КМУВ (2)-(3)
1-й этап	272,2 (125,8–426,9)	371,2 (116,1–714,6)	395,5 (137,1–889,5)	0,547	0,331	0,381	0,735
2-й этап	167,9 (35,0–308,4)	259,9 (70,1–401,2)	112,0 (42,0–662,7)	0,263	0,095	0,348	0,892
3-й этап	249,9 (112,0–475,1)	292,5 (121,1–529,9)	565,9 (122,4–852,5)	0,184	0,313	0,068	0,379

П р и м еч а н и е : sAA — альфа-амилаза; ККУ — критерий Краскела-Уоллиса; КМУВ — критерий Манна-Уитни-Вилкоксона.

Таблица 2

Содержание альфа-амилазы ротовой жидкости в субпопуляциях без предиктов воспаления (с ИЛ-1β≤212 пг/мл) на 1–3-м этапах исследования

sAA, МЕ/л	Основная группа (1), Ме (25%; 75%)	Плацебо -группа (2), Ме (25%; 75%)	Контрольная группа (3), Ме (25%; 75%)	р, ККУ	р, КМУВ (1) — (2)	р, КМУВ (1) — (3)	р, КМУВ (2) — (3)
1-й этап	266,0 (68,1–386,5)	556,3 (118,6–878,1)	395,5 (154,3–910,8)	0,105	0,038	0,140	0,894
2-й этап	167,9 (64,6–333,5)	274,5 (67,6–564,9)	475,6 (62,2–951,2)	0,206	0,157	0,126	0,585
3-й этап	245,4 (81,7–578,5)	264,5 (108,9–529,9)	620,8 (264,9–941,6)	0,05	0,405	0,019	0,095

Примечание: sAA — альфа-амилаза; ИЛ-1β — интерлейкин-1β; ККУ — критерий Краскела-Уоллиса; КМУВ — критерий Манна-Уитни-Вилкоксона.

Концентрацию интерлейкина-1β определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на фотометре Infinity F50 (Tecan) коммерческими тест-системами фирмы ВектоБест (Новосибирск). В качестве материала использовали супернатант ротовой жидкости, полученный центрифугированием проб в пробирках типа эппендорф на 1,5 мл в течение 15 минут при 10000 g и температуре 4°С [15].

Состояние автономной нервной системы оценивали путем вычисления вегетативного индекса Кердо по формуле Index=100* (1-ДА/Пульс), где ДА — диастолическое давление в мм рт.ст. [16].

Статистическая обработка включала проверку вариационных рядов на нормальность распределения по критерию Шапиро — Уилка. В дальнейшем использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела — Уоллиса (ККУ), а также попарные сравнения групп по непараметрическому критерию Манна — Уитни — Вилкоксона в случае получения статистически значимых различий в дисперсионном анализе. Числовые значения биохимических показателей приведены в виде медианы и квартилей (25% и 75%). Различия между вариационными рядами считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты. На первом, докоррекционном, этапе концентрация альфа-амилазы ротовой жидкости различалась незначительно и составила 272,2 (125,8– 426,9) МЕ/л для основной группы, 371,2 (116,1–714,6) МЕ/л для плацебо-группы и 395,5 (137,1–889,5) МЕ/л в контроле. На втором этапе исследования проявилась тенденция к снижению содержания sAA ротовой жидкости во всех группах; по завершении — к понижению, при этом уровень альфа-амилазы был ниже исходных значений в основной и плацебо- группах, в контроле он превысил исходные показатели (все данные не отличаются статистической значимостью) (табл. 1).

Для выявления особенностей колебаний sAA все группы разделены на субпопуляции с предиктором воспалительных заболеваний полости рта (ИЛ-1β>212 пг/мл) и без таковых явлений (ИЛ-1β ≤ 212 пг/мл).

В субпопуляции с предиктором воспалительных стоматологических заболеваний (ИЛ-1β>212 пг/мл) не было статистически значимых изменений между подгруппами, тем не менее прослеживалась тенденция к снижению содержания альфа-амилазы в основной группе к завершению исследования (1-й этап: 331,2 (167,2–1099,7) МЕ/л; 3-й этап: 269,3 (128,1–451,1) МЕ/л, в отличие от групп плацебо (1-й этап: 173,8 (72,6–362,5) МЕ/л; 3-й этап: 380,6 (123,4– 1045,3) МЕ/л) и контроля (1-й этап: 467,6 (105,3– 892,1) МЕ/л; 3-й этап: 568,9 (255,7–568,9) МЕ/л).

В субпопуляциях без предиктора воспалительных процессов полости рта обнаружены статистически значимые изменения в основной и контрольной группах на третьем этапе. Они отражали снижение уровня фермента в основной и его увеличение в контрольной группе, уменьшение концентрации альфа-амилазы в плацебо-группе оказалось статистически незначимым (табл. 2).

При попарном сравнении групп статистически достоверные изменения зафиксированы и в плацебо-группе: субпопуляция плацебо-группы без предиктора воспалительных заболеваний полости рта (ИЛ1β≤212 пг/мл) на втором этапе исследования демонстрирует более выраженное снижение уровня данного фермента в ротовой жидкости на 25,85% (р<0,05) по сравнению с аналогичным периодом субпопуляции плацебо-группы (ИЛ1β>212 пг/мл) c предиктором воспалительных заболеваний, где снижение содержания составляет 21,97% (р=0,031). Обе субпопуляции группы плацебо демонстрируют снижение концентрации альфа-амилазы в данный

Динамика индекса Кердо в группах студентов на 1–3-м этапах исследования

период. Сходная тенденция наблюдалась в парных тестах на втором этапе в основной группе как в субпопуляции ИЛ1β≤212, где снижение уровня амилазы составило 46,04%, так и в субпопуляции ИЛ-1в>212 со снижением 64,25%, но без статистической значимости (р=0,514 и р=0,129). При этом в группе контроля за аналогичный период снижение содержания амилазы было менее выраженным и составило 29,22% (р=0,588) в субпопуляции ИЛ-1р£212.

В процессе исследования все испытуемые продемонстрировали достаточно высокий уровень сим-патикотонии, который снизился на втором этапе и вновь повысился на третьем этапе эксперимента, что можно связать с усилением состояния тревожности перед экзаменационной сессией. Тем не менее к концу эксперимента в основной группе наблюдалось снижение процента симпатотоников до 33,33%, тогда как в группе плацебо количество симпатотоников составило 41,67%, а в контроле 50%. Изменения величины индекса Кердо представлены на рисунке.

Обсуждение. Содержание альфа-амилазы ротовой жидкости (sAA) у участников всех групп в процессе эксперимента превышала нормальные величины: у здоровых, физически активных взрослых в состоянии покоя уровень sAA обычно находится в пределах 50–175 МЕ/мл, при этом стресс вызывает двукратное увеличение: до 110–350 МЕ/мл [17]. В изменениях содержания данного фермента во всех группах и на всех трех этапах эксперимента прослеживалась определенная логика. Так, суммарные показатели уровня альфа-амилазы имели тенденцию к снижению в основной группе на втором и третьем этапах исследования, при этом активность фермента в группах плацебо и контроль повысилась на третьем этапе, что может отражать благоприятное влияние корректировки питьевого поведения на мукозальный иммунитет в целом. Учитывая то, что уровень sAA у всех участников превышал нормальные показатели, необходимо было выяснить, связано ли это с воспалительными заболеваниями полости рта или же подобная активность вызвана учебным стрессом. В ходе обработки данных выяснено, что, несмотря на отсутствие жалоб со стороны участников на наличие стоматологических воспалительных заболеваний, существует необходимость разделения групп на суб- популяции в зависимости от значения ИЛ-1β, что позволило нам выявить достоверные закономерности, скрытые при анализе усредненных цифр. Уровень ИЛ-1β свыше 212 пг/мл [5] — это порог, прогнозирующий периодонтит (78% чувствительность и 100% специфичность). С разделением на субпопуляции у участников без предиктора воспалительных заболеваний (значения ИЛ-1β ≤ 212 пг/мл) зафиксировано статистически достоверное снижение альфа-амилазы на третьем этапе исследования в основной группе относительно контрольной (см. табл. 2). При этом показатели альфа-амилазы недостоверно повысились как в группе плацебо (+24%), так и в контроле (+36,7%).

Разделение групп на субпопуляции показало, что даже у лиц без предиктора воспаления в полости рта содержание sAA превышало норму, что позволяет отнести эти изменения за счет стресс-индуцированного состояния. В процессе исследования все испытуемые продемонстрировали достаточно высокий уровень симпатикотонии (см. рисунок), который снизился на втором и вновь повысился на третьм этапе эксперимента, что можно связать с повышенной нагрузкой перед экзаменационной сессией. Тем не менее к концу эксперимента в основной группе наблюдалось уменьшение процента лиц с симпатикотонией.

Таким образом, статистически значимые изменения, а также тенденции, демонстрирующие улучшение состояния мукозального иммунитета и снижение тонуса симпатической нервной системы, свидетельствуют о благоприятном воздействии откорректированного питьевого поведения на участников настоящего исследования.

Выводы:

• 1.    Выявлена зависимость между снижением уровня альфа-амилазы ротовой жидкости и откорректированным питьевым поведением в субгруппе людей без предиктора воспалительных заболеваний полости рта (ИЛ-1β в ротовой жидкости менее 212 пг/мл), употребляющих доочищенную электромагнитным способом воду в количестве не менее 30–35 мл/кг.

• 2.    Повышение содержания альфа-амилазы ротовой жидкости у обследованных молодых людей в значительной степени связано с повышением тонуса симпатической нервной системы.

• 3.    Изменение питьевого поведения способствует снижению напряженности симпатической нервной системы, что проявляется в уменьшении количества участников с симпатикотонией.