Влияние поли- и аутогемохимиотерапии по схеме САР на кислородзависимую цитотоксичность нейтрофилов при экспериментальном раке яичников

Введение. Рак яичников (РЯ), диагностируемый в основном на распространенной стадии заболевания, представляет актуальную проблему современной онкогинекологии [1]. Согласно данным, опубликованным в Eurocare-5 study, пятилетняя выживаемость больных РЯ не превышает 37,6 % [2]. В России ежегодно регистрируется 13,2 тыс. опухолей яичников и 7,7 тыс. летальных исходов от них [3].

Химиотерапия является вторым основным компонентом лечения РЯ [4–6]. С середины 90-х гг. в США и ряде стран Европы при РЯ используют схему САР. Комбинированная химиотерапия по этой схеме проводится после нерадикальных операций при IIb, IIc, III и IV стадиях РЯ больным с остаточными опухолями и метастазами. Эту же схему используют в качестве первоначального лечения при неоперабельных опухолях. Кроме того, по усмотрению оперирующих врачей, эту схему химиотерапии применяют в качестве профилактической меры при РЯ ранних стадий в случае неуверенности в радикальности операции. Однако лечение РЯ цитостатиками почти в 25 % случаев прекращают из-за развития выраженных побочных эффектов [7].

Метод аутогемохимиотерапии (АГХТ) предусматривает реинфузию клеток крови после их инкубации с лекарственными средствами. Установлено, что инкубация цитостатика с аутокровью приводит к образованию качественно новых противоопухолевых соединений: цитостатик – форменный элемент и цитостатик – белок. При этом в несколько раз возрастает время циркуляции в крови химиопрепарата, который активизируется на поверхности клеток, и усиливается биотрансформация препарата. По мнению авторов [8], все это объясняет низкую дозозависимую токсичность и выраженную противоопухолевую эффективность АГХТ по сравнению с полихимиотерапией (ПХТ) на традиционных растворителях. При этом эффек- тивность АГХТ зависит как от особенностей связывания химиопрепарата с компонентами крови во время инкубации, так и от особенностей самой опухоли.

Хотя гранулоциты являются наиболее распространенными лейкоцитами циркулирующей крови, их роль в механизмах противоопухолевой иммунной защиты долгое время считалась незначительной. Статус гранулоцитов подробно изучался в основном при воспалении и неспецифической иммунной защите. На сегодня показано, что эти клетки выполняют более сложные функции, чем неспецифический киллинг патогенов. Показано их участие в секреции и ответе на цитокины, в сложных системах специфического и неспецифического иммунного ответа [10–12]. Цитотоксический потенциал нейтрофилов (Нф) представлен протеолитическими ферментами, бактерицидными пептидами, активными формами азота и кислорода (АФК). АФК, образующиеся во время респираторного взрыва, непосредственно разрушают чужеродные антигены и опухолевые клетки [12]. При этом формируется широкий спектр АФК, в частности гипохлорная кислота, образующаяся при активации миелопероксидазы (МПО) [13]. Продуцируемые Нф АФК также активируют ингибиторы протеинкиназ, что может привести к элиминации опухолевых клеток [14]. Все эти эффекты имееют место при рассмотрении опухольассоциирован-ных Нф. В то же время АФК, продуцируемые циркулирующими Нф, могут демонстрировать канцерогенные эффекты, увеличивая число мутаций, которые накапливаются и приводят к злокачественному перерождению клеток [15]. Также перекись водорода, продуцируемая Нф, подавляет реакции адаптивного иммунитета [16].

Цель исследования. Оценка влияния АГХТ и ПХТ по схеме САР на кислородзави-симую цитотоксичность нейтрофилов при экспериментальном раке яичников.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования были проведены на белых беспородных крысах массой 180–200 г. Модель рака яичников воспроизводили путем перевивки опухолевого штамма (НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва). Трансплантируемая асцитная опухоль яичника (АОЯ) была получена Е.Е. Погосянц, Е.Л. Пригожиной и Н.Л. Еголиной в 1958 г. Исходный гистологический тип опухоли – метастазирующая папиллярная аденокарцинома, в настоящее время – асцитная опухоль. После предварительного пассажа на 8-й день после внутрибрюшинной перевивки от одной крысы был взят асцит и перевит животным экспериментальной группы в объеме 0,5 мл 9-дневного инокулята (асцитическая жидкость с 7·10⁷ опухолевых клеток в каждой дозе) + 0,5 мл питательной среды 199 на 100 г массы животного. Прогрессирование данного типа опухоли проходит в 3 стадии: логарифмическую (с 4-х сут после перевивки), стационарную (с 8-х сут после перевивки), терминальную (с 13-х сут после перевивки). Все животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. Были соблюдены правила гуманного обращения с животными, которые регламентированы Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных, утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г., положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг., а также требованиями этического комитета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета. Животных умерщвляли путем декапитации под эфирным наркозом. В исследованиях использовали доксорубицин (ДР) («Эбеве», Австрия), циклофосфан (ЦФ) («Конпо», «Евросервис», Россия) и цисплатин (ЦП) («ЛЭНС-ФАРМ», Россия). В качестве антикоагулянта применяли гепарин.

Доза для введения цитостатиков рассчитывалась по номограмме на квадратный метр поверхности тела животного [3] и составляла для доксорубицина 40 мг/м2, для циклофос-фана 600 мг/м2, для цисплатина 75 мг/м2. При совместном введении цитостатиков по схеме САР использовали концентрации вдвое меньше указанных. Введение цитостатиков животным с РЯ проводили на 5-й день после перевивки (логарифмическая стадия развития опухоли). АГХТ осуществляли путем реинфузии крови (1,0 мл), проинкубированной в термостате в течение 45 мин при 37 °С с гемоконсервантом и химиопрепаратом, в яремную вену животных. ПХТ осуществляли путем введения в яремную вену химиопепара-тов, растворенных в физиологическом растворе. Кровь для исследования редокс-статуса периферических эритроцитов забирали через 3 и 8 дней после ПХТ и АГХТ. Цитохимически в Нф определяли активность миелопероксидазы и долю активных Нф в спонтанном варианте НСТ-теста [17]. Результаты выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК).

В работе использовались методы непараметрической статистики. Значимость различий вариационных рядов в связанных попарно выборках оценивалась с помощью U-критерия Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований нами установлено значимое повышение абсолютного и относительного количества Нф в периферической крови и снижение количества Нф в спонтанной НСТ-реакции у крыс с АОЯ по сравнению с интактными животными (табл. 1).

Результаты влияния ПХТ при моновведении и при введении по схеме САР на Нф интактных животных представлены в табл. 2.

Как следует из табл. 2, на фоне ПХТ все препараты при моновведении и введении по схеме САР через 3 дня значимо не изменяют общее количество лейкоцитов и незначительно, но достоверно снижают, по сравнению с начальным уровнем, абсолютное и относительное число Нф. При этом также значимо и существенно снижалась активность МПО в Нф и количество Нф, активных в спонтанном НСТ-тесте на фоне введения всех препаратов, кроме ДР. На 8-й день после введения всех препаратов абсолютное и относительное количество Нф продолжало снижаться. Показатели МПО и НСТ повышались по сравнению с таковыми на 3-й день после введения ЦП, ЦФ и по схеме САР. На фоне моновведения ДР показатели НСТ и МПО снижались. Можно предполагать, что при ПХТ по схеме САР нивелируется негативное влияние ДР на кислородзависимую цитотоксичность Нф периферической крови.

При использовании метода АГХТ на третий день после введения всех препаратов в Нф здоровых крыс значимо не изменялось количество лейкоцитов, абсолютное и относительное количество Нф, однако при этом резко и значимо снижались показатели МПО и НСТ. На 8-й день после введения снижалось, по сравнению с интактными животными, общее количество лейкоцитов. Абсолютное и относительное количество Нф значимо уменьшалось даже по сравнению с показате- лями на 3-й день после введения. Показатели МПО и НСТ были снижены при всех моновведениях и не изменялись при введении по схеме САР.

Показатели кислородзависимой цитотоксичности Нф у крыс с АОЯ на фоне ПХТ и АГХТ при моновведении химиопрепаратов и введении по схеме САР представлены в табл. 3.

Как следует из данных табл. 3, у животных с АОЯ на 3-й день после ПХТ количество лейкоцитов не изменилось, относительное количество Нф возросло на фоне введения по схеме САР, абсолютное количество Нф возросло на фоне ДР, ЦФ и САР по сравнению с показателями до введения. Активность МПО была снижена, а показатели НСТ повышены при всех схемах введения. На 8-й день после ПХТ активность МПО снижена, а показатели НСТ повышены при всех схемах введения.

Таблица 1