Влияние полиморфизма E670G гена PCSK9 на степень атеросклероза сонных артерий у больных гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией в узбекской популяции

Как известно, гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия (ГеСГ) является одним из самых распространённых наследственных заболеваний в мире. Ею страдает 1 из 500 человек в популяции, тогда как гомозиготной (ГоСГ) – 1 из 1 миллиона людей. При этом в 90% случаев заболевание связано c мутацией в гене кодирующем рецепторы ЛПНП (ЛПНП-Р), 5-10% - аполипопротеин В и 1-2% – пропротеин конвертазу субтилизин кексина 9 типа (PCSK9) (1). Однако при этом повышение уровня PCSK9 в крови является общим для всех генетических вариантов ГеСГ, а применение моноклональных антител, блокирующих активность PCSK9, успешным в лечении гиперхолестеринемии.

В 2003 году Abifadel et al. открыли несколько вариантов мутаций гена PCSK9, некоторые из них являлись усиливающими функцию «gain-of-function» (GOF), вызывающими гиперхолестеринемию, в то время как другие – вариантами уменьшения функции «loss-of-function» (LOF), ассоциированные со снижением уровня холестерина и уменьшением риска ИБС [2,3,4,5].

PCSK9 играет важную роль в регуляции уровня холестерина в крови и посредством этого оказывает влияние на процессы атеросклероза [6,7]. Варианты понижающих функцию (LOF) генетических полиморфизмов PCSK9 (Y142X и C679X) уменьшают синтез или секрецию PCSK9 в культурах клеток, что связано с заметно более низкой концентрацией в плазме крови PCSK9 [8]. В ряде исследований было установлено влияние повышающего функцию (GOF) генетического полиморфизма E670G гена PCSK-9 на липидный спектр и выраженность коронарного атеросклероза [9,10], хотя в других это не подтвердилось [11,12].

В связи с вышеизложенным, целью исследования было изучить структурно-функциональные особенности атеросклероза сонных артерий у больных гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией с учётом уровня PCSK-9 и генетического полиморфизма E670G гена PCSK-9.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 57 больных с хронической ишемической болезнью сердца (ХИБС) и семейной гетерозиготной гиперхолестеринемией (ГеСГ, I группа). Группу сравнения составили 144 пациента с ХИБС без ГеСГ (II группа).

Для верификации диагноза и оценки тяжести состояния больных оценивались факторы риска: повышенное артериальное давление (АД), курение, индекс массы тела, сахарный диабет и структурно-функциональные параметры: ЭКГ в 12 отведениях, эхокардиография с оценкой систолической и диастолической функции миокарда, дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий, 24-часовое суточное мониторирование ЭКГ, стресс-тест и, при необходимости, коронарография.

Ультразвуковое исследование брахиоцефальных артерий проводили на «SIEMENS» Асuson Х700 (Германия) линейным датчиком с частотой 7 МГц [20м].

Для оценки липидного спектра и маркеров воспаления изучали следующие параметры: общий холестерин (ОХ), холестерин липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП), холестерин липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП), триглицериды (ТГ), высокочувствительный С-реактивный белок, биохимические показатели (АЛТ, АСТ, КФК) на анализаторе Daytona (Randox, Ireland). Коэффициент атерогенности (КАХ) определяли по следующей формуле: КАХ = (ОХ – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП (отн. ед). Уровень пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9) определяли методом иммуноферментного анализа с использованием реактивов «Human Proprotein Convertase 9/PCSK9 ELISA Kit» (MULTI SCIENCE, China).

Генотипирование полиморфизма E670G (rs505151) PCSK9 проводили с использованием ПЦР-метода. Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляли при помощи набора для выделения ДНК «DiatomTM DNA Prep 200: Isogene, Россия» со- гласно протоколу фирмы производителя.

Для выявления полиморфизма E670G гена PCSK9 были использованы прямой 5`-CACGGTTGT GTCCCAAATGG-3` и обратный 5`-GAGAGGGACAAGTCGGAACC-3` праймеры (7). Праймеры для ПЦР были синтезированы компанией ООО «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия).

Статистический анализ. При проведении статистического анализа полученных данных использованы возможности пакета статистического анализа Statistica 6.0. Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М±SD), статистическая значимость полученных измерений при сравнении средних величин определялась по критерию Стьюдента (t) с вычислением вероятности ошибки (Р) при проверке нормальности распределения. Если распределение изучаемых переменных отличалось от нормального, применяли непараметрические критерии анализа: критерий Вилькоксона для проверки различий между двумя выборками парных измерений; критерий Т Манна-Уитни для двух выборок. Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод χ 2, а также точный критерий Фишера для небольших выборок.

Соответствие эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга оценивали по критерию χ 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При сравнении частоты генотипов и аллелей полиморфизма E670G (rs505151) гена PCSK9 у пациентов с ГеСГ, не ГеСГ и здоровых лиц (табл. 1), количество аллелей G было в 2 раза выше в I группе (13,11.4%), чем во II (17,6.0%) и в 3 раза (1, 3.0%), чем у здоровых (контрольная группа), однако различия носили недостоверный характер. Частота изучаемых генотипов соответствовала равновесному распределению Харди-Вайнберга (P>0.05).

Таблица 1. Сравнение частоты генотипов и аллелей полиморфизма E670G (rs505151) гена PCSK9 у пациентов с ГеСГ, не ГеСГ и здоровых лиц (n, %)*

Генотипы и аллели	I, ГеСГ (n=57)	II, не ГеСГ (n=144)	Все пациенты (n=201)	III, здоровые (n=17)
АА	46 (80.7%)	128 (89.0%)	174 (86.6%)	16 (94.1%)
AG	9 (15.8%)	15 (10.3%)	24 (11.9%)	1 (5.9%)
GG	2 (3.5%)	1 (0.7%)	3 (1.5%)	0
A	101 (88.6%)	271 (94.0%)	372 (92.5%)	33 (97.0%)
G	13 (11.4%)	17 (6.0%)	30 (7.5%)	1 (3.0%)

- различия недостоверны

Сравнение результатов дуплексного сканирования сонных артерий у больных ГеСГ (табл. 2) показало, что толщина комплекса интима-медиа (ТКИМ) сонных артерий слева (1.14±0.18, P<0,01) и справа (1.15±0.16, P<0,01) была выше, чем в группе сравнения, 1.05±0.17 и 1.04±0.18, соответственно. Также, у них было большее количество атеросклеротических бляшек в левой (66.7% против 50,0%, P<0,05) и правой (68.4% против 43,0%, P<0,01) общей (ОСА) и внутренней (ВСА) сонных артериях. При этом средний % стеноза слева (43.4%) и справа (42.3%) был выше, чем в группе сравнения (28.3% и 27.2%, соответственно, P<0,05).

Таблица 2. Сравнительная характеристика структурнофункциональных изменений брахиоцефальных артерий у больных ИБС с ГеСГ и не ГеСГ (M±SD, n (%)

Параметры	I, ГеСГ (n=57)	II, не ГеСГ (n=144)
ТКИМ слева, мм	1.14±0.18**	1.05±0.17
ТКИМ справа, мм	1.15±0,16**	1.04±0.18
Наличие атеросклеротической бляшки слева (ОСА, ВСА)	38 (66.7%)*	72 (50.0%)
Наличие атеросклеротической бляшки справа (ОСА, ВСА)	39 (68.4%)**	62 (43.0%)
% стеноза слева (ОСА, ВСА)	43.4%*	28.3%
% стеноза слева (ОСА, ВСА)	42.3%*	27.2%

Примечание: *,**,*** - P<0,05, P<0,01, P<0,001 достоверность различий между I и II группами

При исследовании структурных изменений общей и внутренней сонных артерий с учётом особенностей распределения полиморфных вариантов E670G гена PCSK-9 было обнаружено, что у больных ГеСГ, носителей G-аллеля, наряду с более высокой частотой сердечно-сосудистых осложнений (инфаркт, инсульт, аортокоронарное шунтирование в анамнезе) достоверно чаще выявлялись атеросклеротические бляшки в сонных артериях: у 11 (100%, P<0,05), против 28 (61%), что также свидетельствует о большей выраженности мультифокального атеросклероза (табл. 3).

Важность оценки структурно-функционального состояния сонных артерий у больных ГеСГ подтверждается результатами корреляционного анализа. Как видно из таблицы 4, между величиной ТКИМ сонных артерий и частотой развития ИМ в анамнезе у больных ГеСГ имелась положительная корреляционная связь (r=0,38, Р<0,05) что позволяет использовать ТКИМ в качестве важного

Таблица 4. Оценка корреляционной связи между исходными клиническими параметрами и толщиной комплекса интима-медиа у больных ГеСГ

№ Параметры r Спирмена P 1 Возраст -0,09 НД 2 Мужской пол 0,28 НД 3 Сахарный диабет 0,25 НД 4 Инфаркт миокарда 0,38 <0,05 5 Общий холестерин 0,07 НД 6 ХС ЛПНП 0,15 НД 7 ТГ 0,02 НД 8 ХС ЛПВП -0,07 НД 9 КА 0,21 НД 10 Глюкоза в крови 0,29 <0,05 11 вчСРБ 0,05 НД 12 PCSK-9 0,31 <0,05 13 Носительство G-аллеля 0,39 <0,05 прогностического маркера прогрессирования атеросклероза. Также повышение уровня глюкозы, концентрации PCSK-9 в крови и носительство аллеля G полиморфизма E670G гена PCSK-9 являются важными прогностическими маркерами поражения ТКИМ сонных артерий и, следовательно, риска развития ССО (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что полиморфизмы генов, регулирующих LDL-рецепторы, уровень PCSK9 и ApoB наиболее часто являются генетической причиной развития ГеСГ. При этом, по данным литературы, в большинстве случаев именно генетические полиморфизмы loss-of-function (LOF), связанные со снижением уровня PCSK9, в частности, R46L (rs11591147), признаются ведущими регуляторами его действия [13,14].

Таблица 3. Сравнение исходных клинико-гемодинамических показателей у пациентов с ГеСГ и не ГеСГ в зависимости от носительства аллеля G E670G (rs505151) полиморфизма гена PCSK9 (M ± SD, n (%)

Параметры	I, ГеСГ (n=57)		II, не ГеСГ (n=144)
	AА (n=46)	АG + GG (n=11)	AA (n=128)	АG + GG (n=16)
Средний возраст, годы	48.7±10,1	51.8±9,0	61.6±9.8	59.4±9.0
Пол (муж/жен)	17/29 (37%/63%)	7/4 (64%/36%)	59/69 (46%/54%)	11/5 (69%/31%)
АГ, n (%)	41 (89%)	11 (100%)	111 (87%)	15 (94%)
Инфаркт миокарда в анамнезе, n (%)	21 (45.6%)	9 (82.0%)*	37 (29.0%)	5 (31.0%)
Инсульт в анамнезе, n (%)	3 (6.5%)	3 (27.3%)*	3 (2.3%)	1 (6.2%)
Аорто-коронарное шунтирование	1 (2.2%)	4 (36.4%)***	8 (6.25%)	2 (12.5%)
Чрескожные коронарные вмешательства	13 (28.0%)	5 (45.5%)	21 (16.4%)	3 (19.0%)
ТКИМ слева, мм	1.11±0.15	1.17±0.21	1.04±0.14	1.06±0.20
ТКИМ справа, мм	1.13±0.14	1.17±0.18	1.03±0.17	1.05±0.19
Наличие атеросклеротической бляшки слева (ОСА, ВСА)	28 (61.0%)	10 (91.0%)	65 (50.8%)	7 (43.8%)
Наличие атеросклеротической бляшки справа (ОСА, ВСА)	28 (61.0%)	11 (100%)*	55 (43.0%)	7 (43.8%)
% стеноза слева (ОСА, ВСА)	42.2%	45.7%	25.2%	31.4%
% стеноза слева (ОСА, ВСА)	39.8%	46.9%	24.9%	29.5%

Примечание: *,**,*** - P<0,05, P<0,01, P<0,001 достоверность различий между AА- и G-носителями

Вместе с тем, однонуклеотидный полиморфизм E670G (rs505151) гена PCSK9 распознан во многих исследованиях, как ведущая усиливающая («gain-of-function», GOF) мутация в увеличении концентрации ХС ЛПНП в крови, особенно у мужчин (9,10). Так, например, Chen et al. [9] исследовали генетические полиморфизмы, повышающие функцию PCSK9 (GOF) у пациентов, участвовавших в исследовании эффективности флувастати-на – LCAS. Они обнаружили, что носительство G-аллели генотипа 23968A>G (E670G) ассоциировало с увеличением ХС ЛПНП и коронарным атеросклерозом. Своё наблюдение они подтвердили в исследовании TexGen среди популяции c нормальным уровнем ХС ЛПНП (средний уровень ХС ЛПНП 108 мг/дл), в котором частота аллеля G была ниже, чем в исследовании LCAS (0,043 против 0,074; x² =5,5; P=0,019), а GG-генотип отсутствовал среди обследованных. В другом исследовании Evans and Beil [10] изучили частоту встречаемости 23968A>G (E670G) полиморфизма гена PCSK9 у пациентов, обратившихся в амбулаторное отделение госпиталя Университета Гамбург. Ими установлена связь носительства аллеля G с повышением уровня ХС ЛПНП, но только среди мужчин в Европейской популяции. В ряде исследований также установлена связь носительства G-аллели генотипа 23968A>G (E670G) с увеличением ТКИМ сонных артерий [15] и степени коронарного атеросклероза [16]. Однако это не подтвердилось в некоторых исследованиях [17]. Также в литературе указывается на связь E670G полиморфизма гена PCSK9 с увеличением риска инсульта, вызванного атеросклерозом крупных артерий [18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У больных гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией в узбекской популяции установлена прямая корреляционная связь между инфарктом миокарда в анамнезе, толщиной комплекса интима-медиа сонных артерий, повышением концентрации PCSK-9 в крови и носительством аллеля G полиморфизма E670G гена PCSK-9, что позволяет использовать их в качестве прогностических маркеров риска развития сердечно-сосудистых осложнений.