Влияние полисахаридов Hericium erinaceus BP16 на криоустойчивость спермы быков

Криосохранение спермы высокопродуктивных пород крупного рогатого скота актуально на протяжении нескольких десятилетий. Известно, что любое воздействие на сперму в процессе ее замораживания-оттаивания изменяет структуру (уменьшаются размеры сперматозоидов, особенно площадь и периметр головки) и биохимические свойства гамет [1–4]. Стандартный метод криоконсервации включает замораживание спермы в парах жидкого азота до -80° C на высоте 1–10 см и последующее хранение при -196° C [5]. Основной целью большинства экспериментов по криоконсервированию спермы является разработка криопротекторных растворов, в состав которых могут быть включены антиоксиданты, сахара, витамины, экстракты растений для сохранения или восстановления морфологии, жизнеспособности, подвижности, а также целостности мембран, акросом и ДНК гамет. В настоящей работе в каче- стве антиоксиданта мы применили полисахаридные фракции Hericium Erinaceus. Известно, что препараты, полученные на основе полисахаридного комплекса H. Erinaceus, обладают антиоксидантным [6–8], гепатопротекторным [9, 10], гиполипидемическим [11], антимикробным [12, 13], противоопухолевым [8, 14–16], иммуномодулирующим [17], гастропротекторным [18–20], нейропротекторным [21–23] и другими видами физиологических действий. Важной особенностью полисахаридов H. Erinaceus является наличие в его молекуле функциональных групп, которые взаимодействуют с молекулами глицерина, образуя водородные связи, что позволяет достичь наибольшей эффективности раствора для сохранения функций сперматозоидов.

Цель нашей работы – изучение влияния полисахаридных фракций H. Erinaceus на криоустойчивость спермы.

Материалы и методы

Культивирование и получение плодовых тел H. Erina-ceus

В работе использовали штамм H. Erinaceus BP16 (нуклеотидная последовательность фрагмента ITS1_5.8S_ ITS2 депонирована в NCBI под номером MK809367), полученный методом культуры ткани из собранного в природе плодового тела гриба, выращенного на лигноцеллюлозном субстрате, состоящем из дубовых опилок, зерна овса и соломы (1:3:6 об. %) в стеклянных емкостях объемом 500 мл. Для этого в стерилизованный автоклавированием (121° С, 1 атм., в течение 25 мин) субстрат после охлаждения асептически вносили блоки (ø 10 мм, 2 шт./емкость) с грибным мицелием, вырезанные из 15-суточной газонной культуры на сусло-агаре (4° С). Емкости с инокулированным субстратом инкубировали при комнатной температуре (20±1° С) и естественном световом режиме. По мере формирования грибом плодовых тел их срезали и высушивали при 60° С в сушильном шкафу (СМ 50/400-60 ШС, Россия) или замораживали при - 20° С в электроморозильнике «Derby» (Дания).

Получение полисахаридных фракций из плодовых тел H. Erinaceus

Навески измельченных сухих и замороженных плодовых тел подвергали экстракции по отдельности. Сырье заливали последовательно водой при +20° и +70° С, затем 5%-ным водным раствором NaOH при +20° С. На всех этапах осуществляли непрерывное перемешивание в течение 3 ч. Остаток сырья отделяли центрифугированием. Контроль экстракции полисахаридов выполняли фенол-сернокислотным методом [24]. При положительной реакции на углеводы экстракт сливали, а остаток сырья повторно заливали экстрагентом (водой или 5%-ным раствором NaOH), повторяя манипуляцию до отрицательной реакции на углеводы в экстракте. Методом центрифугирования (13 тыс.об/мин, в течение 40 мин) получали супернатант с последующим высушиванием. Получены две полисахаридные фракции: из замороженных плодовых тел – PF1, из сухих плодовых тел – PF2.

Определение химического состава полисахаридных фракций PF1 и PF2

Количественное определение нейтральных моносахаридов в виде соответствующих ацетатов полиолов после полного (в течение 3 ч) кислотного гидролиза фракций 2М трифторуксусной кислотой проводили газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ). Использовали хроматограф «Varian 450-GC» (США) с пламенно-ионизационным детектором, капиллярную колонку VF-5 ms «Varian» (США), 0,25 мм, 30 м, гелий в качестве газа-носителя. Газожидкостную хроматографию ацетатов полиолов осуществляли в программе: от 175° (1 мин) до 250° C (2 мин) со скоростью 3° C/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора [25]. В качестве внутреннего стандарта применяли мио-инозит «Sigma» (США).

В полисахаридных фракциях, помимо моносахаридного состава, определяли содержание уроновых кислот спектрофотометрическим методом, основанным на реакции продуктов окисления углеводов с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты, с использованием градуировочного графика, построенного для растворов галактуроновой кислоты. Измерение проводили при двух длинах волн 400 и 450 нм на спектрофотометре UNICO 2800 (США) [22].

Содержание белка определяли по методу Лоури [26], используя градуировочный график, построенный для растворов бычьего сывороточного альбумина.

Сбор спермы

Быки-производители голштинской породы (n=20; возраст – 2-3 года) - постоянные доноры спермы, содержались на предприятии ОАО «КировПлем» (Россия). Условия содержания были оптимальными и одинаковыми для каждого быка. Сперму собирали с использованием искусственного влагалища (+42° С).

Охлаждение и отогрев сперматозоидов

Свежеполученную сперму делили на три экспериментальные группы. Контрольную группу (КГ) разбавляли в соотношении 1:5 с раствором в составе (вес/объем): 2,75 г ТРИС (AppliChem, Германия), 0,8 г – глюкоза (NeoFroxx, Германия), 0,3 г – мальтоза (NeoFroxx, Германия), 1,4 – лимонная кислота (CDH, Индия), 6 мл – глицерин (АО Химре-актив, Россия), 20 мл – желток куриный, бидистиллиро-ванная вода до 100 мл. При приготовлении растворов для экспериментальных групп (ЭГ1 и ЭГ2) к указанному составу раствора добавляли по 0,25 г PF1 или 0,25 г PF2 и в дальнейшем также смешивали со спермой в соотношении 1:5. Далее для оценки криозащитных свойств полисахаридных фракций смесь разливали по криопробиркам по 500 мкл и помещали в воздушную среду холодильника ТВЛ-К 050Б (ЗАО «ИнСовт», Россия) при температуре +5° С на 2 ч, после чего переносили в электрический морозильник Vestfrost (Дания) при температуре –80° С для хранения. Отогрев осуществляли в водяной ванне при +37° С после семи суток хранения.

Определение подвижности сперматозоидов

До охлаждения и после отогрева проводили анализ биологических параметров спермы с помощью программного обеспечения Аргус-CASA, которая включала фазово-контрастный микроскоп (CX43RF Olympus, Япония), программное обеспечение, цифровую камеру, ПК, укомплектованный принадлежностями. Для этого каплю спермы вносили в счетную камеру Маклера (Counting chamber Makler®, Sefi Medical, Israel) и исследовали в фазово-контрастном свете.

Для расчета показателей подвижности сперматозоидов рассматривали только прогрессивно подвижные клетки как основной объект дальнейших исследований.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного комплекса XLSTAT 2016. Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (при числе исследуемых – менее 50) или критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых – более 50). В случае отсутствия нормального распределения коли- чественные данные описывали с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3). Сравнение по показателю статистической значимости оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса при р<0,05. Результаты исследования представлены в виде медианы и 25-го и 75-го центилей (Ме, Q1-Q3).

Результаты и их обсуждение

Подвижность сперматозоидов является одним из наиболее важных показателей фертильности [27]. Оценивали следующие показатели подвижности: прямолинейная скорость VSL (микрон/сек), криволинейная скорость VCL (микрон/сек), средняя скорость пути VAP (микрон/сек), среднее угловое смещение MAD (град), линейность LIN (%), перекрестная частота биений BCF (Гц). Оценивали не менее 200 сперматозоидов по каждому параметру подвижности из предусмотренных протоколом исследования программы AprycCASA.

Смешивание спермы с исследуемыми растворами перед криоконсервацией вызывает изменение различных показателей кинематики. Так, значения показателей VSL, VCL, BCF в группе ЭГ1 статистически значимо выше, чем в группе КГ, а показателей VAP и BCF – выше, чем в группе ЭГ2 (табл. 1).

После хранения сперматозоидов при –80 °С в течение семи суток данные группы КГ (без полисахаридных фракций) статистически значимо отличались от ЭГ1 и ЭГ2 по следующим параметрам подвижности: от ЭГ1 – MAD и LIN, от ЭГ2 – VCL, MAD, BCF.

Таблица 1

Показатели подвижности у прогрессивных сперматозоидов после смешивания спермы с контрольным и исследуемыми растворами, содержащими полисахаридные фракции H. Erinaceus (Ме, Q1-Q3)

Table 1

Motility indicators of progressive spermatozoa after mixing semen with control solution and test solutions containing polysaccharide fractions of H. erinaceus (Me, Q1-Q3)

Показатели кинематики	Исследуемые группы
	КГ	ЭГ1	ЭГ2
VSL	31,27 (21,71–48,29)	41,14 * (30,98–51,43)	36,67 (24,96–46,17)
VCL	75,20 (54,79–97,59)	89,27 * (70,99–107,24)	84,57 (67,14–99,46)
VAP	52,38 (36,96–64,69)	52,48 (42,66–60,88)	48,67# (34,79–56,01)
MAD	51,97 (43,76–63,27)	50,58 (43,46–59,39)	49,14 (43,65–61,94)
LIN	50,24 (38,83–62,82)	46,51 (39,42–54,96)	44,42 (36,28–51,59)
BCF	70,86 (43,41–115,10)	103,25 * (67,21–125,17)	71,48# (52,80–99,56)

Примечание. Здесь и в табл. 2: * – отличие от показателей КГ статистически значимо при р<0,05; # – отличие от показателей ЭГ1 статистически значимо при р<0.05.

Note. Here and in Table 2: *– difference from KГ (control group) indicators is statistically significant at p<0,05; # – difference from ЭГ1 (experimental group) indicators is statistically significant at p<0.05.

Таблица 2

Показатели подвижности у прогрессивных сперматозоидов экспериментальных групп после отогрева после семи суток хранения при температуре –80° С (Ме, Q1-Q3)

Table 2

Motility indicators of progressive spermatozoa from the experimental groups warmed after 7-day-long storage at –80° C (Me, Q1-Q3)

Показатели кинематики	Исследуемые группы
	КГ	ЭГ1	ЭГ2
VSL	25,73 (20,42–30,74)	28,45 (20,96–34,76)	25,19 (19,97–30,64)
VCL	59,79 (54,42–68,35)	61,97 (52,53–75,03)	71,60 * (59,38–85,18)
VAP	26,05 ( 16,40–33,22)	29,18 (22,74–35,09)	29,00 (23,96–32,84)
MAD	56,50 (48,88–68,43)	50,45 * (43,99–61,13)	50,96 * (44,87–58,45)
LIN	36,34 (27,22–44,93)	40,97 * (30,95–52,14)	39,35 (31,62–49,11)
BCF	39,68 (9,74–47,26)	38,20 (23,50–52,35)	46,15 * (36,51–66,16)

Таким образом, экспериментальные растворы, содержащие полисахаридные фракции H. Erinaceus , сохраняют более высокий уровень показателей подвижности, чем контрольный раствор. Данный эффект можно проследить как непосредственно после смешивания спермы с растворами, так и после низкотемпературного хранения. Мы полагаем, что это достигается за счет формирования водородных связей между гидроксильными группами полисахарида и глицерина, а также благодаря наличию антиоксидантной активности у полисахаридных фракций H. erinaceus . Необходимо дальнейшее исследование полисахаридов в сохранении репродуктивной функции клеток, в том числе на более длительные сроки.