Влияние поверхности имплантатов для остеосинтеза на секреторную активность многоклеточных систем in vitro

По мнению исследователей в области медицинского материаловедения и биоинженерии тканей, именно на границе раздела искусственного материала (имплантата) и биологических структур развиваются основные события, связанные с гистогенезом и жизнедеятельностью клеток, на основе общебиологических процессов пролиферации, коммитирования, дифференцировки, созревания и гибели [16, 21]. В подобном случае судьба клеточной популяции связана с суммарным воздействием, опосредованным через прямое взаимодействие клеток с искусственной поверхностью и секреторную активность многоклеточной системы [12].

Биологическая реакция на искусственные материалы определяется рядом факторов, включая топографию поверхности, химический состав, скорость деградации, тип продукта растворения и механические свойства имплантата. Поэтому в настоящее время разрабатываются подходы к использованию материалов с технологическими и биологическими свойствами для конкретных заболеваний и пациентов, что входит в понятие «интеллигентные имплантаты» [16] и «персонализированная терапия» [23].

В основе негативного влияния материала лежит каскад событий, характерных для воспаления. Показано, что эти события приводят к развитию гранулематозной реакции со стороны окружающих тканей и активации секреции цитокинов и протеолитических ферментов [16], выраженность и длительность выделения которых является определяющей для развития патологического состояния.

Тем не менее до сих пор не выработаны надежные критерии, позволяющие прогнозировать судьбу (при-живление/отторжение) имплантата в организме.

В связи с этим цель исследования была связана с изучением секреции цитокинов, процессов апоптоза и продукции активных форм кислорода в клеточных культурах при их контакте in vitro с имплантатами, несущими различные кальцийфосфатные покрытия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для культивирования тестируемых клеток применяли подложки из наноструктурного титана ВТ1.0 (диаметр 12 мм, толщина 1 мм), несущие двусторонние кальцийфосфатные (КФ) покрытия. Покрытия наносили на титановую подложку с помощью модификации способа микродугового оксидирования [22], магнетронного напыления [15] либо абляционной плазмы [10].

Шероховатость поверхности искусственных КФ-покрытий оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (разрешающая способность 1 нм). Определяли Ra (мкм) как средний результат шероховатости в пределах нескольких длин участков измерений согласно ГОСТ 2789-73.

В качестве тестируемых многоклеточных систем использовали культуру пренатальных фибробластоподобных клеток легкого, как источник стромальных стволовых клеток, а также мононуклеарную фракцию лейкоцитов периферической крови человека. Культуральной посудой служили 24-луночные пластиковые планшеты Costar (площадь лунки 1,77 см²). Биологическое тестирование выполняли in vitro при 37 °С в течение 24 часов.

Характеристики популяций мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из различных тканей очень схожи [17]. Они обнаружены в эмбриональной [13] и легочной тканях [18], в связи с чем использованная нами в экспериментах культура пренатальных фибробластоидных клеток легкого человека (ООО «Банк стволовых клеток», г. Томск) может служить источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Препараты представляют собой популяцию фибробластоподобных клеток разной формы и размеров, что характерно для пула ММСК [13], сохраняющую при пассажах стабильный кариотип и онкогенно безопасную. Клетки свободны от посторонних вирусных (ВИЧ, гепатит, герпес и др.) и бактериальных агентов (сифилис, микоплазмы, хламидии и др.). Жизнеспособность клеток, определяемая согласно ISO 10993-5 по исключению окрашивания в тесте с 0,4 % трипановым синим, составила 93 %.

Изучение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) и ее костного изофермента в кондиционных средах культуры ММСК выполнялось по общепринятой биохимической технике с применением стандартного колориметрического метода [11].

Взвесь стромальных клеток использовалась в концентрации 9×104 жизнеспособных кариоцитов в 1 мл культуральной среды следующего состава: 15 % инактивированной при 56 °С эмбриональной телячьей сыворотки (НПО «Вектор»), 280 мг/л L-глутамина, DMEM среды до 100 мл. Контролем роста служила культура фибробластоподобных клеток на пластике.

Фракционирование периферической крови взрослого человека для выделения мононуклеарных лейкоцитов проводили центрифугированием на градиенте плотности 1,077 г/см3 Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) при 500 g в течение 45 мин. Содержание мононуклеаров составило 85 % при жизнеспособности 90 % в тесте с 0,4 % трипановым синим. В каждую лунку добавляли взвесь мононуклеаров в конечной концентрации 106 клеток/мл культуральной среды следующего состава: 10 % инактивированной при 56 °С эмбриональной телячьей сыворотки, 280 мг/л L-глутамина, 90 % среды RPMI-1640.

После культивирования жидкую часть культуры забирали, центрифугировали при 500 g в течение 15 мин. В надосадочной жидкости (супернатантах) определяли уровни фактора некроза опухоли (TNFa) и интерлейкинов (IL-2, IL-4) методом ИФА.

Концентрацию TNFα, IL-2, IL-4 в супернатантах фибробластоподобных и мононуклеарных клеток определяли с помощью наборов для ИФА производства «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов проводили с использованием фотометра для микропланшетов («Multiscan EX», USA). Концентрацию TNFα, IL-2 или IL-4 рассчитывали по калибровочной кривой.

Для оценки апоптоза исследуемые мононуклеары крови в количестве 1 × 106 переносили в объеме 1 мл в пробирки для проточного цитофлюориметра, ресуспен-дировали в аннексиновом буфере, содержащем ФИТЦ-меченный аннексин V и пропидий йодид, инкубировали 15 мин. в темноте при комнатной температуре [14]. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США).

Уровень наработки активных форм кислорода (АФК) в клетках определяли методом проточной цитометрии [4] с помощью дихлорфлуоресцеина диацетата (ДХФ-ДА). Анализ образцов клеток проводился на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США) с помощью гистограмм FL-1 и соответствующих им окон статистики, содержащих показатели средней геометрической интенсивности свечения меченых клеток.

Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна–Уитни (U-тест). С целью выявления связи между исследуемыми показателями определяли коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (r). Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Постановка эксперимента позволила оценить секреторную активность фибробластоподобных клеток, в которой костная фракция ЩФ занимала 88 % в общем пуле секретируемого в культуре фермента.

Костная фракция ЩФ считается маркером остеобластов [5], дифференцирующихся в течение 3–4 суток культивирования из ММСК. Другими клетками в культуре, судя по морфологии, были производные кроветворной стволовой клетки (нейтрофилы, моно-циты/макрофаги). Цитохимическая окраска культуры фибробластоподобных клеток на неспецифическую эстеразу [3] подтвердила результаты морфологического исследования. Изменение секреции IL-2 и IL-4 при контакте с искусственными поверхностями (табл. 1) также подтверждало присутствие среди фибробластоподобных стромальных клеток гемопоэтических элементов.

Имплантаты с шероховатым (среднее Ra = 2,947 мкм, n = 3) КФ покрытием, сформированным микро-дуговым способом, не влияли на секрецию цитокинов в культуре фибробластоподобных клеток (табл. 1). Судьба ММСК в данном случае определяется преимущественно физическими свойствами искусственной поверхности, что и было отмечено ранее [21].

При контакте c «гладкими» КФ-покрытиями жизнедеятельность клеточной культуры может зависеть от выделения TNFa (магнетронный способ нанесения покрытия, Ra = 0,197 мкм, n = 3) или торможения секреции IL-2 и IL-4 (абляционный способ нанесения покрытия, Ra = 0,127 мкм, n=3). При этом эффективность роста костной ткани на подобных покрытиях в тесте эктопического остеогенеза in vivo не превышала 30 % в сравнении с 75–80 % для шероховатых микродуговых покрытий [20].

Таким образом, секреторная активность многоклеточной системы в культуре фибробластоподобных клеток при контакте с «гладкими» искусственными покрытиями может быть одним из молекулярных механизмов в регуляции функциональной активности клеток и судьбы имплантатов в организме.

С одной стороны, кооперация макрофагов и Т-хелперов через цитокиновую регуляцию функции остеокластов (TNFα и IL-2) и фибробластов (TNFα) способна запускать воспалительный/остеолитический (склеротический) процесс [16]. Избыток TNFa, недостаток IL-2 и IL-4, выявленные нами для разных изделий (табл. 1), являются проапоптотическими сигналами для лейкоцитов [1], мигрирующих в очаг постимплантационного воспаления. В связи с этим тканевая многоклеточная система при контакте с «гладкими» КФ-покрытиями может вызывать апоптоз иммунокомпетентных клеток крови, опосредованный через цитокины. Внутриклеточные пути реализации подобного варианта клеточной смерти описаны [6–9]. Данные процессы могут затруднять прогноз выживаемости подобных имплантатов в конкретном организме.

Известно, что при использовании медицинских изделий развивается воспалительная реакция, активность и исход которой модулируются не только местными стромальными элементами, но и циркулирующими мононуклеарными иммунокомпетентными клетками [16]. In vitro ответ мононуклеаров крови, включая цитокиновый профиль, различается в зависимости от состава искусственных материалов [19].

В наших экспериментах образцы наноструктурного титана с КФ-покрытиями дифференцированно стимулировали in vitro секреторную активность мононукле -арных лейкоцитов крови человека (табл. 2). Так, отмечалось увеличение концентрации TNFα (на 93 %) и IL-4 (на 15 %) в культуре клеток при контакте с абляционным и микродуговым покрытиями соответственно.

Таблица 1

Уровни цитокинов в супернатанте при культивировании фибробластоподобных клеток человека с искусственными материалами, Х±m

№ группы	Исследуемая группа, n = 3	Уровень цитокинов, пг/мл
		TNFα	IL-2	IL-4
Контроль секреции
1	Культура фибробластоидных клеток человека на пластике	46,52±0,67	78,01±0,44	66,33±1,28
Культуры клеток на образцах наноструктурного титана с кальцийфосфатным покрытием
2	Микродуговое покрытие	51,56±3,93	77,57±1,07	68,77±3,61
3	Абляционное покрытие	46,91±2,79	72,14±1,16*	49,98±0,67*
4	Магнетронное покрытие	62,26±3,47*	77,32±1,59	65,86±3,33
Примечание: здесь и в табл. 2–3 n — число наблюдений (образцов) в каждой группе; указаны различия по U-критерию Вилкоксона: (*) — с группой 1 (p < 0,05)

Таблица 2

Уровни цитокинов в супернатанте при культивировании мононуклеаров крови человека с искусственными материалами, Х±m

№ группы	Исследуемая группа, n = 3	Уровень цитокинов, пг/мл
		TNFα	IL-2	IL-4
Контроль секреции
1	Культура мононуклеаров крови человека на пластике	41,74±0,60	63,74±0,93	63,91±0,70
Культуры клеток на образцах наноструктурного титана с кальцийфосфатным покрытием
2	Микродуговое покрытие	40,98±1,25	66,88±1,30	73,36±1,66*
3	Абляционное покрытие	79,19±2,08*	61,51±1,02	61,73±0,80
4	Магнетронное покрытие	59,74±15,53	67,27±1,45	68,35±3,41
Примечание: здесь и в табл. 2–3 n — число наблюдений (образцов) в каждой группе; указаны различия по U-критерию Вилкоксона: (*) — с группой 1 (p<0,05)

Тестируемые материалы обладают хорошей биосовместимостью на клеточном уровне, поскольку не вызывают увеличения апоптоза мононуклеаров крови и концентрации внутриклеточных АФК (табл. 3). Тем не менее тест на окрашивание с 0,4 % трипановым синим показал некоторый рост числа окрашенных клеток (с 9 до 14 %) при контакте культуры клеток крови с абляционным КФ-материалом. По-видимому, часть клеток в данной группе погибала путем некроза, индуцированного высокими дозами TNFα (табл. 2), что уменьшало долю апоптотически измененных мононуклеаров (табл. 3).

Использование корреляционного анализа для выявления механизмов описанных феноменов показало, что секреторная активность культуры фибробластоподобных клеток не зависела от шероховатости КФ-покрытий. В то же время выявлены тесные зависимо- сти Ra покрытий с секрецией мононуклеарами крови TNFα (r = –0,80; p = 0,01; n = 9), Il-2 (r = 0,69; p = 0,04; n = 9) и IL-4 (r=0,83; p = 0,006; n = 9).

Представленные данные раскрывают взаимосвязь физических свойств поверхности имплантатов и цитокиновых механизмов их различной способности к остеоинтеграции, показанной нами ранее [20].

Исследование выполнено при поддержке федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007–2012 годы» (государственный контракт № 02.512.11.2285 от 10.03.2009), «Научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 годы» (02.740.11.0311 от 07.07.2009), грантов РФФИ №09-04-00287а и №09-04-99105-р_офи.

Таблица 3

Количество апоптозных клеток и уровень внутриклеточных активных форм кислорода при культивировании мононуклеаров крови человека с искусственными материалами, Х±m

№ группы	Исследуемая группа, n = 3	Результат измерений
		число клеток в апоптозе, %	активные формы кислорода, (у. е.)
1	Культура мононуклеаров крови человека на пластике	13,78±5,31	0,550±0,290
Культуры клеток на образцах наноструктурного титана с кальцийфосфатным покрытием
2	Микродуговое покрытие	11,66±2,41	0,236±0,048
3	Абляционное покрытие	7,99±0,66*	0,190±0,010*
4	Магнетронное покрытие	13,34±0,46	0,316±0,050

ВЫВОДЫ

• 1.    Согласно корреляционному анализу клетками, способными через модуляцию секреторной активности регулировать процессы приживления/ отторжения имплантатов с разной топографией кальцийфосфатной поверхности, являются, в первую очередь, мононуклеарные лейкоциты крови.

• 2.    При средней шероховатости кальцийфосфатных покрытий в диапазоне 0,1-3 мкм, в качестве статистически значимого критерия, позволяющего в мо

• 3.    Имплантаты с «гладкими» кальцийфосфатными покрытиями менее пригодны для репаративной регенерации костной ткани вследствие высокой вероятности секреции TNFa, по-видимому, как проявление неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем [2].

дельных экспериментах in vitro на 80 % прогнозировать поведение имплантата в организме, можно рекомендовать определение секреции TNFa моно-нуклеарами периферической крови.