Влияние препаратов с противоопухолевой активностью - доксорубицина и циклофосфана - на структурную реорганизацию миокарда крыс и численность кардиомиоцитов

В настоящее время кардиотоксические доза-зависимые эффекты установлены для многих препаратов, используемых для проведения химиотерапии. К ним, прежде всего, относятся антрациклиновые антибиотики, реже – ци-клофосфан (ЦФ), 5-фторурацил, таксаны, цисплатин и др. [1, 2, 6, 8, 11]. Кардиотокси-ческие эффекты химиотерапии подразделяют на острые, хронические и отсроченные. Наиболее значительное ремоделирование сердца и тяжелые формы сердечной недостаточности выявляются в более поздние сроки после завер- шения химиотерапии и характерны в основном для антрациклиновых антибиотиков.

В серии проведенных нами фундаментальных исследований было установлено, что цитотоксические свойства антрациклиновых антибиотиков (в частности, доксорубицина и рубицина) обусловлены их негативным влиянием на процессы воспроизводства ультраструктур кардиомиоцитов (КМЦ), приводящим к угнетению их внутриклеточной регенерации, а развивающаяся в таких условиях сердечная недостаточность была классифицирована как регенераторно-пластическая [5, 6]. В качестве основных молекулярных механизмов ингибирования процессов внутриклеточной регенерации КМЦ антрациклиновыми антибиотиками рассматриваются их способность интеркалировать в молекулу ДНК и генерация свободнорадикальных процессов, вследствие чего происходит значительное изменение физико-химических характеристик сарколеммы и внутриклеточных мембран, изменяются сигнально-трансдукторные пути, интенсивность биосинтетических процессов, в ряде случаев усиливается индукция апоптоза [4, 6].

Кардиотоксические свойства других цитостатиков, в частности циклофосфана, изучены в меньшей степени. Считается, что в цитотоксичности ЦФ важнейшую роль играет интенсификация свободнорадикальных реакций [2]. Однако характер структурных изменений миокарда при действии алкилирующих соединений практически не изучен. Не выяснены также основные типы повреждений КМЦ, не установлены возможности и типы их регенерации.

Цель исследования – изучить характер структурной реорганизации миокарда экспериментальных животных при действии доксорубицина и ЦФ с оценкой общей численности КМЦ в сердце как интегрального показателя выраженности регенераторных реакций.

Материал и методы

Комплексный морфологический анализ миокарда крыс Вистар выполнен при моделировании доксорубициновых и циклофосфановых повреждений миокарда. Исследования проведены на 32 крысах-самцах Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на две группы: крысам 1-й группы (n=10) вводили однократно внутрибрюшинно доксорубицин (ДОК) («ЛЭНС-Фарм», Москва) в дозе 7 мг/кг; животным 2-й группы (n=10) – однократно внутрибрюшинно ЦФ («Биохимик», Саранск) в дозе 125 мг/кг. Контрольным животным (n=12) внутрибрюшинно однократно вводили физиологический раствор в соответствующем их массе тела объеме. Половину животных всех групп декапитировали с использованием эфирного наркоза через 3 сут, другую половину – через 14 сут после введения препаратов. Эксперименты проведены в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986) и одобренными биоэтическим комитетом НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН.

После вскрытия грудной клетки сердце быстро отделяли от окружающих тканей и взвешивали. Для получения парафиновых срезов образцы фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, для получения полутонких срезов – в 4 % растворе параформальдегида с постфиксацией в четырехокиси осмия и заливкой в смесь эпона и аралдита. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса и по ван Гизону. Полутонкие срезы окрашивали 1 % раствором азура II. Исследование и морфометрический анализ (измерение диаметра КМЦ) проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000B» с использованием цифровой фотокамеры «Leica DFC 320» и компьютерной программы «Leica QWin».

Для количественной оценки общей популяции КМЦ в сердце применяли метод щелочной диссоциации фиксированных тканей [3]. Кроме общей численности КМЦ в сердце, определяли количественное соотношение одно-, дву- и многоядерных (3 и более ядер) КМЦ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Общетоксические свойства ДОК и ЦФ оценивали по уровню летальности и изменениям массы тела. Однократное введение ЦФ (в дозе 125 мг/кг) вызывало гибель 25 % животных (смерть наступала на 7–10-е сут после введения препарата), в то время как после однократного введения ДОК (в дозе 7 мг/кг) в исследованные сроки эксперимента летальных исходов не было. Масса тела снижалась при введении обоих цитостатиков на протяжении всего эксперимента, но в наибольшей степени – через 14 сут после введения ДОК (на 34 %, р<0,05) (таблица).

Кардиотоксические свойства ДОК и ЦФ проявлялись в повреждениях КМЦ, уменьшении массы сердца, диаметра и общей численности КМЦ. Если после однократного введения ЦФ уменьшение этих показателей наблюдалось в течение первых 3 сут эксперимента, то однократное введение ДОК обусловливало значительное уменьшение всех показателей в течение всего эксперимента (таблица). Через 14 сут после введения ДОК масса сердца снижалась на 24 % (р<0,05), диаметр КМЦ – на 25 % (р<0,05), а их абсолютная численность – на 39 % (р<0,05). Снижение абсолютной численности КМЦ было обусловлено их гибелью преимущественно путем апоптоза [4] и ингибированием пролиферации. Отсутствие существенных изменений численности КМЦ в сердце через 3 сут после введения ЦФ свидетельствует о сохранении клеточной формы их регенерации. Через 14 сут после введения ЦФ абсолютная численность КМЦ в сердце была даже увеличена (на 48 %), хотя и не достоверно, что могло быть обусловлено пролиферацией клеток.

Ведущим типом повреждения КМЦ после действия цитостатиков являются литические повреждения (нарушение компактной упаковки и разрежение миофибрилл, выраженное просветление цитоплазмы, образование очагов

Таблица

Морфометрический анализ и количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце крыс Вистар после воздействия доксорубицина и циклофосфана (M±m)

Показатель	Ведение доксорубицина		Ведение циклофосфана
	контроль	ДОК	контроль	ЦФ
3 сут
Масса тела, г	222,7 ± 6,4	217,0 ± 22,4	204,0 ± 7,0	198,0 ± 8,3
Масса сердца, г	0,89 ± 0,03	0,84 ± 0,07	0,79 ± 0,05	0,70 ± 0,03
Диаметр кардиомиоцитов, мкм	14,99 ± 0,20	13,32 ± 0,17	15,80 ± 0,13	16,14 ± 0,58
Концентрация кардиомиоцитов, 103/мг ткани	14,654 ± 0,487	15,340 ± 1,120	17,343 ± 0,809	17,334 ± 1,268
Абсолютная численность кардиомиоцитов в сердце, х106	11,086 ± 0,453	9,610 ± 0,200*	12,316 ± 0,252	11,607 ± 1,199
Количество клеток, %:
одноядерных	19,7 ± 0,5	15,6 ± 2,1	21,5 ± 5,3	14,9 ± 0,4
двуядерных	79,2 ± 0,5	83,1 ± 1,8	75,1 ± 5,6	82,6 ± 0,7
многоядерных (3 и более ядер)	1,1 ± 0,2	1,3 ± 0,5	3,4 ± 0,3	2,5 ± 0,3
14 сут
Масса тела, г	319,0 ± 3,8	209,4 ± 17,0*	248,3 ± 15,9	226,7 ± 14,2
Масса сердца, г	1,03 ± 0,03	0,78 ± 0,08*	0,76 ± 0,04	0,76 ± 0,08
Диаметр кардиомиоцитов, мкм	14,75 ± 0,38	11,03 ± 0,36*	16,65 ± 0,16	16,05 ± 0,24
Концентрация кардиомиоцитов, 103/мг ткани	14,811 ± 0,500	15,656 ± 0,664	13,087 ± 1,733	19,651 ± 2,996
Абсолютная численность кардиомиоцитов в сердце, х106	13,807 ± 1,029	8,429 ± 1,055*	9,237 ± 1,411	13,716 ± 2,792
Количество клеток, %:
одноядерных	14,3 ± 0,7	9,5 ± 0,4**	30,5 ± 2,7	26,5 ± 7,9
двуядерных	85,5 ± 0,8	90,3 ± 0,4	66,9 ± 2,2	70,2 ± 7,3
многоядерных (3 и более ядер)	0,2 ± 0,1	0,2 ± 0,1	2,5 ± 0,5	3,2 ± 0,8

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (p<0,05), ** – различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (p<0,01).

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. №4 (46)

«опустошения», преимущественно вблизи ядер) (рис. 1). Через 3 сут после однократного введения ДОК отмечалась мозаичность окрашивания миокарда кислыми красителями, обусловленная присутствием КМЦ как с литическими, так и контрактурными повреждениями. Наблюдались некроз и некробиоз отдельных КМЦ со скоплениями в данных участках мононуклеаров. Повреждения и гибель КМЦ носили, как правило, диффузный характер с развитием диффузного или мелкоочагового кардиосклероза. Нарушения кровообращения в виде значительного венозного полнокровия и развития выраженного межволоконного и интерстициального отека способствовали разволокнению миокарда.

Через 14 сут после воздействия ДОК литические повреждения КМЦ и интерстициальный отек сохранялись, у некоторых животных – усиливались. В результате гибели КМЦ формировались мелкие очаги кардиосклероза. Выраженные литические изменения и уменьшение (на 25 %, р<0,05) диаметра КМЦ (атрофические изменения) в этот срок связаны с нарушением воспроизводства внутриклеточных структур, т.е. развитием регенераторно-пластической недостаточности. Ультраструктурными эквивалентами регенераторно-пластической недостаточности КМЦ являются диффузный лизис миофибрил-лярных пучков, расширения межмембранного околоядерного пространства и профилей агранулярной саркоплазматической сети, усиление аутофагоцитоза с формированием крупных остаточных телец [1, 5].

После введения ЦФ у большинства животных через 3 сут эксперимента сохранялась нормальная архитектоника миокарда. В то же время отмечались литические и контрактурные изменения отдельных КМЦ. Для циклофосфанового повреждения миокарда характерно появление КМЦ с вакуолеобразными околоядер-ными «опустошениями» цитоплазмы. Регистрировались мелкоочаговые некрозы миокарда. Одновременно у всех животных данной группы манифестировали нарушения гемодинамики, прежде всего венозное и капиллярное полнокровие, лимфостаз, периваскулярный и интерстициальный отек.

Через 14 сут после введения ЦФ нарушения

Рис. 1. Микрофото. Литические изменения кардиомиоцитов, интерстициальный отек через 3 сут после введения доксорубицина. Окраска гематоксилином и эозином. ×400

Рис. 2. Микрофото. Митотическое деление ядер кардиомиоцитов через 3 сут после введения циклофосфана.

Окраска гематоксилином и эозином. ×1250 гемодинамики сохранялись. Следует отметить, что практически у всех животных кровеносные сосуды и капилляры, кроме форменных элементов крови, содержали плазму, наблюдались также явления плазморрагии. Количество КМЦ с литическими и вакуолеобразными изменениями цитоплазмы возрастало по сравнению с предыдущим сроком. Наблюдались небольшие очаги некроза и некробиоза КМЦ и их инфильтрация мононуклеарами. Следует отметить также умеренную диффузную мононуклеарную инфильтрацию стромы миокарда и усиление периваскулярного склероза.

При характеристике регенераторных потенций КМЦ после однократного введения ДОК и ЦФ следует отметить появление КМЦ с митотическим делением ядер (рис. 2) и популяции КМЦ небольших размеров («малые» КМЦ) длиной около 40 мкм с близко расположенными ядрами, что не свойственно зрелым КМЦ

Рис. 3. Микрофото. Выраженная мозаичность окрашивания кардиомиоцитов; появление «малых» кардиомиоцитов через 3 сут после введения циклофосфана. Окраска гематоксилином и эозином. ×400

(рис. 3). Малые КМЦ располагались чаще на концах мышечных волокон, где они формировали своеобразные точки роста. В ряде случаев отмечался интермедиантный рост мышечных волокон – за счет деления клеток, расположенных в середине волокон. Кроме митотического деления ядер КМЦ и телофаз, в миокарде встречались также картины формирования вставочных дисков между разделившимися малыми КМЦ (цитокинез) с образованием одноядерных клеток. Выявление фаз митоза ядер КМЦ и формирование вставочных дисков (цитокинеза) с очевидностью свидетельствуют об их делении. К важным характеристикам индуцированного кардиомиогенеза следует отнести формирование кластеров новообразованных клеток.

Усиление фенотипической гетерогенности (в том числе появление атрофированных клеток) и снижение абсолютного числа КМЦ в сердце после введения ДОК и ЦФ сопровождались изменением соотношения одно- и двуядерных КМЦ, а именно уменьшением доли одноядерных клеток и соответствующим увеличением доли двуядерных клеток (см. таблицу). Доля одноядерных клеток после введения ДОК уменьшалась через 3 и 14 сут эксперимента соответственно на 20 % и 34 %, после введения ЦФ – на 31 % и 13 % соответственно.

По нашим данным и результатам других исследователей [2, 7, 9, 10], одноядерные КМЦ сохраняют способность вступать в клеточный цикл, завершающийся кариокинезом и цитокинезом. Кариокинез без цитокинеза одноядерных КМЦ приводит к снижению их СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. №4 (46)

процентного содержания и, соответственно, к увеличению доли двуядерных клеток. Поддержание пула одноядерных КМЦ (репликативного пула) происходит за счет кариокинеза и завершенного цитокинеза. Двуядерные КМЦ преобладают в миокарде взрослых крыс и являются не только основными структурнофункциональными элементами миокарда, но и главным компенсаторно-приспособительным резервом миокарда (гипертрофируются при усилении функциональной нагрузки). По данным количественного анализа популяции КМЦ у контрольных и опытных животных пул двуядерных КМЦ варьирует от 70 до 85 % от общего числа КМЦ, пул многоядерных КМЦ не превышает 3 %. Снижение доли одноядерных КМЦ после введения цитостатических препаратов может быть обусловлено не только кариокинезом (образованием двуядерных клеток), но и гибелью этих клеток и свидетельствовать об истощении репликативного резерва миокарда, невозможности со временем восполнения численности КМЦ. Возможно, эти механизмы лежат в основе развития кардиомиопатий и отсроченной сердечной недостаточности после проведения химиотерапии.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что однократное введение ДОК и ЦФ вызывает преимущественно литические повреждения КМЦ, сопровождающиеся их атрофией и апоптотической гибелью, которые обусловливают развитие регенераторнопластической недостаточности. Наиболее значительные повреждения КМЦ развиваются после введения ДОК и вызывают заметное уменьшение численности КМЦ в сердце и его инволюцию. После введения ДОК происходит также наиболее значительное уменьшение репликативного пула миокарда – доли одноядерных КМЦ. В то же время митотическая активность КМЦ и появление в миокарде после цитотоксических воздействий популяции «малых» КМЦ свидетельствуют об индукции регенераторных реакций. В наибольшей степени регенераторные реакции КМЦ выражены после введения ЦФ.

Учитывая многоуровневость организации регенераторных процессов в миокарде после повреждающих воздействий, которые направлены на восстановление внутриклеточной организации КМЦ, их численности и особенностей архитектоники, мы считаем возможным введение такого понятия, как регенераторный потенциал миокарда. Интегральная оценка регенераторного потенциала миокарда должна включать анализ митотической активности КМЦ, изменения соотношения одно- и двуядерных клеток, изменения размеров КМЦ (атрофические или гипертрофические процессы), выраженность процессов внутриклеточной регенерации.

Выявленная возможность обновления пула КМЦ после воздействия цитотоксическими агентами, представленные морфологические эквиваленты пролиферативной активности КМЦ и подходы к количественной оценке репликативного резерва миокарда [3, 7] обосновывают необходимость поиска эффективных стимуляторов пролиферативной активности КМЦ для коррекции химиотерапевтических повреждений миокарда.