Влияние прерывистой гипобарической гипоксии на экспрессию HIF-1 и морфофункциональные изменения в миокарде

Введение. В настоящее время достаточно хорошо известны пато- и саногенные эффекты гипоксии, ее пре- и посткондициони-рующие воздействия на организм [1–4]. Широкое применение в медицинской практике получили методы прерывистой (интервальной) нормо- и гипобарической гипоксии, которые показали свою эффективность в профилактике, терапии и реабилитации нарушений сердечно-сосудистой системы [5–8], дыхания [9], крови [10], метаболизма [11] и т.д.

В последние годы широко обсуждается прекондиционирующий эффект гипоксии – повышение толерантности органов и тканей к ишемии после однократного или серии гипоксических воздействий и реоксигенации [12, 13].

Установлено, что предварительное гипоксическое воздействие приводит к повышению устойчивости структур миокарда к экспериментальной ишемии (окклюзия венечных артерий) и реоксигенации [2, 12], уменьшению зоны некроза и сохранению высокой сократительной способности миокарда в этих условиях [12, 13]. Показано, что в основе прекондиционирующего действия гипоксии лежит совокупность тканевых и молекулярно-клеточных изменений [12], однако вопрос об их реализации на уровне отдельных органов и тканей остается открытым.

Триггером, запускающим совокупность системных и тканевых механизмов адаптации, является гипоксией индуцированный фактор (hypoxia inducible factor) Hif-1 [14, 15].

Hif-1 представляет собой гетеродимер, состоящий из 2 субъединиц: кислородoчув-ствительной субъединицы Hif-1α и конститутивно экспрессируемой субъединицы Hif-1β [14]. Установлено, что β-субъединица экспрессируется постоянно, а экспрессия α-субъ-единицы регулируется кислородом. При нор-моксии содержание Hif-1α поддерживается на низком уровне. В цитозоле Hif-1α подвергается протеосомальной деградации в кислородозависимых реакциях гидроксилирования с участием пролилгидроксилаз (РHD 1–3), которые являются молекулярными сенсорами О 2 и белка гена тумор-супрессорного протеина фон Хиппеля–Линдау (von Hippel–Lindau protein, pVHL) [10, 16].

При снижении уровня кислорода Hif-1α не гидроксилируется и транслоцируется в ядро, где образует транскрипционный комплекс с Hif-1β, который связывается с особыми последовательностями ДНК в генах, запуская совокупность реакций, направленных на компенсацию и адаптацию к гипоксии [9, 15]. В настоящее время известны около 180 генов, экспрессируемых Hif-1α, включая гены регуляции эритропоэза, роста эндотелия сосудов (ангиогенеза), тонуса сосудов, клеточной пролиферации, апоптоза, липогенеза и т.д. [12].

Влияние на аккумуляцию Hif-1α могут оказывать свободные радикалы, образующиеся при гипоксии [12, 13]. Имеются сведения, что окислительный стресс сопровождается инактивацией пролилгидроксилазных реакций, которые, ограничивая протеосо-мальную деградацию Hif-1α, способствуют его аккумуляции [12].

Принято считать, что Hif-1α является универсальным сигнальным белком, который экспрессируется практически во всех органах и служит механизмом реализации компенсаторно-приспособительных процессов в организме при гипоксии различного генеза [10, 14, 15].

Проведенные нами ранее исследования показали, что при гипоксии механизмы кислородного обеспечения разных органов имеют свои особенности, которые определяют морфофункциональную гетерогенность и гетерохронность формирования процессов адаптации [17]. Исходя из этого можно полагать, что при гипоксии уровень экспрессии Hif-1α в разных органах также будет иметь свои особенности.

Цель исследования. Оценить экспрессию Hif-1α, активность свободнорадикального окисления и морфофункциональные изменения в миокарде на разных этапах адаптации к прерывистой гипобарической гипоксии.

Материалы и методы. Исследование проводилось на 96 крысах-самцах линии Wistar массой 200–250 г, которые содержались в условиях вивария при свободном доступе к воде и сбалансированному корму. Исследования выполнялись в соответствии с рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 742 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных»).

Гипоксические воздействия моделировались в барокамере с имитацией подъема животных на высоту 6500 м над у. м. (Рв – 330 мм рт. ст.). Схема эксперимента включала 5-минутное снижение барометрического давления, экспозицию на «высоте» в течение 10 мин, повышение барометрического давления в течение 5 мин с последующим 5-минутным периодом пребывания животных в условиях нормоксии. Каждый сеанс прерывистой гипобарической гипоксии (ПГГ) включал три указанных цикла. Сеансы ПГГ проводились ежедневно, 6 раз в неделю, на протяжении 30 сут.

До и после каждого гипоксического цикла из хвостовой артерии у животных брали 0,1 мл крови для определения напряжения О 2 , СО 2 (РаО 2 , РаСО 2 ) и рНа. Определение газового состава и кислотно-основного состояния (КОС) крови проводили с использованием микрогазоанализатора АМЕ-1 (Radiometer, Denmark).

Оценку структурных изменений в миокарде, активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ), экспрессии Hif-1α проводили в контрольной группе и в группах животных после однократного сеанса ПГГ (1-е сут), на 15-е и 30-е сут эксперимента.

Для оценки морфофункциональных изменений в миокарде проводили эвтаназию животных с использованием гексенала и КСl. После взвешивания сердца образцы миокарда левого желудочка использовали для приготовления гистологических препаратов с помощью общепринятых методик с окраской гематоксилин-эозином и по Ван Гизону.

В отдельной серии исследований после эвтаназии животных через канюлю в левом желудочке сердца проводили инъецирование кровеносного русла водной взвесью черной туши, которое осуществляли под контролем перфузионного давления. После приготовления просветленных гистологических препаратов (толщина срезов 3–5 и 20 мкм) часть их докрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону.

С использованием световой микроскопии определяли диаметры мышечных волокон (Dv), рассчитывали количество волокон (Nv) и капилляров (Nv) на единицу поверхности среза.

Оценку экспрессии Hif-1α проводили с использованием методики полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для получения тотальной РНК ткань сердца помещали в лизирующий раствор («НПФ ЛИТЕХ», Россия) на 10 мин, затем проводили выделение РНК с использованием набора реактивов «Проба-НК» («ДНК-технология», Россия) по протоколу производителя. Для разрушения вторичной структуры РНК и эффективного отжига праймеров полученный образец тотальной РНК (10 мкл,

1 мкг/мкл) инкубировали в течение 5 мин при 65 °С. Затем образец охлаждали и добавляли к 10 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции (реактивы «Евроген», Россия). В качестве отрицательного контроля использовали образцы, содержащие вместо M-ML V-ревертазы (обратной транскриптазы) соответствующее количество деионизированной воды. Реакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе CFX96 TouchRealTime («ДНК-Технология», Россия) при 42 °С в течение 60 мин, после чего смесь инкубировали 10 мин при 70 °С для остановки реакции.

Праймеры для определения уровня экспрессии м-РНК генов Hif-1α подбирали на основе открытых публичных данных GeneBank с использованием программы OligоMaster. Специфичность выбираемых праймеров и оценку температуры отжига проводили с использованием программы Primer-BLAST. Вычисление уровня экспрессии гена выполняли по методу относительного определения.

Для оценки процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты ткань сердца промывали охлажденным 0,9 % NaCl, просушивали на фильтровальной бумаге и замораживали. Гомогенат ткани миокарда готовили на охлажденном гипотоническом буфере следующего состава: 10 мМ TRIS (pH 7,4), 10 мM KCl, 1 мМ PMSF. Интенсивность свободнорадикальных процессов оценивали по уровню вторичного продукта ПОЛ – малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой [18] с максимумом поглощения при 535 нм.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в миокарде определяли по способности антиоксидантного энзима конкурировать с нитро-синим тетразолием за супероксидный анион [18]. Активность каталазы определяли по скорости утилизации Н 2 О 2 в реакционной смеси, в которую вносили биологический материал, содержащий фермент, при длине волны 260 нм, на которой Н 2 О 2 имеет максимум светопоглощения [18].

Активность глутатион-S-трансферазы и МДА оценивали спектрофотометрически в пересчете на 1 мг белка для ткани. Белок определяли по методу Брэдфорда [18].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных математических программ Statistica 6.0, MS Excel 2010. Достоверность различий рассчитывали по t-критерию Стьюдента, различия считали достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты исследования показали, что во время каждого цикла на всех этапах ПГГ (1–30-е сут) артериальное напряжение О2 снижается и варьирует в диапазоне 52,0–57,5 мм рт. ст., т.е. на уровне, близком к критическому (50 мм рт. ст.), ниже которого возникают метаболические и структурные клеточные нарушения [5]. Уста- новлено, что во время отдельных циклов ПГГ в первый день эксперимента в артериальной крови отмечаются снижение рНа и тенденция к увеличению РаСО2, что свидетельствует о наличии смешанных форм метаболического и респираторного ацидоза (табл. 1). Во время 5-минутного периода нормоксии эти изменения полностью нивелируются, активная реакция крови сдвигается в сторону компенсированного респираторного алкалоза. Таким образом, каждый последующий цикл ПГГ начинается на фоне компенсации гипоксемии и тканевой гипоксии, возникающих во время предшествующих гипобарических воздействий.

Таблица 1

Изменения газового состава и pH артериальной крови при нормоксии и гипобарической гипоксии в разные сроки адаптации к ПГГ (М±m)

Показатель	1-е сут ПГГ		15-е сут ПГГ		30-е сут ПГГ
	Нормоксия	Гипоксия	Нормоксия	Гипоксия	Нормоксия	Гипоксия
PaO 2 , мм рт. ст.	95,0±1,9	52,0±1,3*	96,1±1,6	53,3±1,7*	96,5±1,8	56,5±2,2*
PaСO 2 , мм рт. ст.	36,5±2,1	39,6±1,2	36,6±1,8	33,3±1,3	35,8±1,7	30,1±1,1*
pHa	7,400±0,001	7,320±0,001*	7,420±0,002	7,450±0,001	7,430±0,001	7,45±0,001*

Примечание. * – различия достоверны по сравнению с показателями при нормоксии, р≤0,05.

В последующие сроки эксперимента (15–30-е сут) наряду с выраженной артериальной гипоксемией отмечается увеличение рНа и снижение РаСО 2 . Эти изменения, с одной стороны, являются следствием повышения эффективности респираторной компенсации метаболических изменений, а с другой – связаны с улучшением доставки и утилизации О 2 тканями, включая сердце [17]. Увеличению транспорта О 2 при гипоксии способствуют перераспределение кровотока в органы и ткани с высоким уровнем окислительного метаболизма, включая сердце, увеличение количества функционирующих капилляров [17], активация ангиогенеза [19], стимуляция эритропоэза [5, 9], повышение активности митохондриальных ферментов [12].

Результаты исследования показали, что двухнедельный курс ПГГ приводит к достоверному повышению общего количества капилляров в миокарде крыс на 14 % (р≤0,05), с последующим их увеличением на 19,8 % (р≤0,05), что, по-видимому, связано с активацией ангиогенеза в процессе адаптации к гипоксии (табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют об увеличении капиллярного резерва миокарда, что является одним из признаков структурной адаптации сердца. Увеличение площади капиллярного русла в эти сроки приводит к повышению отношения количества капилляров и волокон миокарда выше 1,0, что способствует снижению диффузионных расстояний для О 2 (табл. 2), улучшению кровоснабжения и кислородного обеспечения сердца, расширяет резервный потенциал сердечной мышцы.

При обзорном рассмотрении гистологических препаратов установлено, что после однократного сеанса ПГГ в первые сутки эксперимента в миокарде отмечаются выраженные реактивные изменения: просветление кардиомиоцитов, их ядер, умеренное расширение интерстициальных и паравазальных пространств, признаки полиморфноклеточной инфильтрации, свидетельствующие о повышении сосудистой проницаемости. На этом фоне появляется тенденция к увеличе- нию диаметров волокон миокарда. В последующие сроки ПГГ (15–30-е сут) указанные реактивные изменения полностью исчезают, диаметр волокон миокарда восстанавливается и практически не отличается от данных в контроле.

Таблица 2

Сосудисто-тканевые отношения в миокарде крыс в разные сроки адаптации к прерывистой гипобарической гипоксии (М±m)

Показатель	Контроль	1-е сут ПГГ	15-е сут ПГГ	30-е сут ПГГ
Nc, мм2	3230±162	3170±162	3689±130*	3867±121*
Nv, мм2	3457,2±196,0	3362±176	3398±193	3475±207
Dv, мкм	10,1±0,7	12,6±0,3*	11,5±0,9	11,0±0,8
Nc/Nv, у. е.	0,93±0,07	0,94±0,06	1,08±0,05*	1,08±0,06*

Примечание. Здесь и далее: * – различия достоверны по сравнению с контролем, р≤0,05.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о фазовых изменениях в миокарде при действии ПГГ: на ранних этапах адаптации (1-е сут) отмечаются реактивные изменения, которые по мере увеличения гипоксических воздействий приводят к образованию стабильных перестроек, характеризующих формирование структурной адаптации.

Поскольку основная роль в развитии компенсаторно-приспособительных измене- ний при гипоксии отводится Hif-1 [14], в ходе исследования оценивали уровень его экспрессии на разных этапах адаптации к ПГГ.

Результаты исследования показали, что в контрольной группе животных (рис. 1) исходный Hif-1α в миокарде находится на низком уровне (0,03±0,01 у. е.), подвергаясь в условиях нормоксии протеосомальной деградации в цитозоле с участием кислородозависимых реакций гидроксилирования и убикви-тинации [10, 15].

□ Нормоксия    D Гипоксия

Рис. 1. Экспрессия HIF-1α в миокарде крыс в разные сроки адаптации к прерывистой гипобарической гипоксии

После сеанса ПГГ в первый день эксперимента уровень Hif-1α в миокарде увеличивается в 11,6 раза (р≤0,001), что, очевидно, связано с инактивацией пролилгидроксилазных реакций (PHD 1–3), индукцией транскрипционных процессов, последующей транслокацией Hif-1α в ядро, гетеродимеризацией с HIF-1ß, образованием транскрипционного активного компонента (HRE) и экспрессией Hif-1 – зависимых генов-мишеней [10, 16]. В число этих мишеней входят белки семействa фaктoров ростa эндотелия сосудов (VEGF), которые являются гликопротеинами, влияющими на образование новых кровеносных и лимфатических сосудов [19] . Можно полагать, что именно VEGF при гипоксической экспрессии Hif-1α является одним из механизмов увеличения общего количества капилляров в миокарде.

Имеются сведения, что таким образом экспрессия Hif-1α запускает цепь компенсаторно-приспособительных реакций уже при однократном гипоксическом воздействии [13, 15]. Установлено, что в условиях нор-моксии при стабилизации кислородного режима ткани Hif-1α достаточно быстро снижается [10, 15]. Важную роль в этом играет активация PHD в присутствии молекулярного кислорода, которая модифицирует HIF-1α, взаимодействуя с фактором von Hippel– Lindau (VHL) и приводит к его протеосо-мальной деградации [14, 16].

Результаты исследования показали, что на 15-е сут эксперимента исходный уровень Hif-1α в миокарде повышается на 40 % по сравнению с контрольной группой, а на 30-е сут снижается и практически не отличается от данных в контроле (рис. 1). Поскольку в процессе восстановления кислородного режима тканей HIF-1α подвергается протео-сомальной деградации, можно полагать, что некоторое его увеличение в миокарде на 15-е сут эксперимента сопряжено с кислородонезависимыми механизмами и, в частности, со свободнорадикальными процессами [12].

Есть сведения, что свободнорадикальные процессы, которые активируются во время гипоксии и в постгипоксический период, вызывают инактивацию пролилгидроксилазных реакций и, соответственно, VHL, что способствует аккумуляции HIF-1α [14, 16].

На фоне относительно высокого исходного уровня Hif-1α на 15-е сут эксперимента сеанс ПГГ сопровождается выраженной его экспрессией, уровень которой мало отличается от отмеченного в первый день ПГГ.

На позднем этапе адаптации (30-е сут) уровень экспрессии Hif-1α при ПГГ в миокарде заметно снижается. При этом нужно отметить, что если в первые дни ПГГ (1–15-е сут) высокая активность Hif-1α соотносится с выраженными реактивными изменениями, то снижение аккумуляции HIF-1α при гипоксии на 30-е сут в целом соответствует сформировавшимся в этот период структурным изменениям в миокарде и может служить критерием становления стабильной фазы адаптации сердца к гипоксии. В литературе имеются сведения, что у высокоустойчивых к гипоксии крыс экспрессия Hif-1α в условиях дефицита О 2 выражена в значительно меньшей степени, чем у низкоустойчивых животных [12]. Более того, причиной различий экспрессии Hif-1α может служить наличие полиморфизмов гена, которые не только определяют высокую резистентность к гипоксии, но и являются причиной наследственного эритроцитоза («чувашский эритроцитоз»), гемохроматоза, опухолевого роста и ангиогенеза [20, 21].

Таким образом, сравнительно низкую экспрессию Hif-1α при гипоксии на 30-е сут эксперимента следует расценивать как критерий формирования морфофункциональных изменений. При этом снижение Hif-1α по мере адаптации к гипоксии, по-видимому, ограничивает его взаимодействие с генами-мишенями, экспрессия которых может привести к неконтролируемым молекулярноклеточным изменениям, однако этот вопрос требует своего самостоятельного изучения.

Одним из важных механизмов, определяющих успешность адаптации сердца к гипоксии, является повышение устойчивости к повреждающему действию активных форм кислорода [22], которые участвуют и в регуляции кислородонезависимых путей образования Hif-1α [12, 16, 20].

Результаты исследования показали, что уровень МДА в миокарде в первый день экс- перимента увеличивается в 2,1 раза (р≤0,001), на 15-е сут – в 1,6 раза (р≤0,001) (табл. 3). На 30-е сут эксперимента уровень МДА в миокарде снижается и достоверно не отличается от контрольного значения. Поскольку МДА является продуктом ПОЛ, можно полагать, что курс ПГГ сопровождается увеличением интенсивности свободнорадикальных процессов в миокарде, которые наиболее вы- ражены в первые две недели эксперимента. Причины образования активных форм кислорода при гипоксии многообразны и связаны с изменениями на уровне электронтранспорт-ной цепи митохондрий, окислением катехоламинов, активацией ксантиоксигеназной системы, приводящей к образованию супероксидного радикала [12].

Таблица 3

Изменения показателей ПОЛ-АОЗ в миокарде крыс в разные сроки адаптации к прерывистой гипобарической гипоксии (М±m)

Показатель	Контроль	1-е сут ПГГ	15-е сут ПГГ	30-е сут ПГГ
Каталаза, моль/мин/л	0,339±0,028	0,562±0,012*	0,428±0,032	0,459±0,023*
Глутатион-S-трансфераза, мкмоль/мин/мг	0,025±0,002	0,071±0,009*	0,051±0,005*	0,076±0,005*
СОД, у. е.	1,447±0,132	0,920±0,246	1,440±0,082	1,424±0,111
МДА, мкмоль/мг	2,584±0,351	5,632±1,071*	4,085±0,869*	3,282±0,426

Оценивая увеличение продуктов ПОЛ как результат активации свободнорадикальных процессов, можно полагать, что возрастает и их роль в экспрессии Hif-1α во время ПГГ на 1–15-е сут эксперимента. При этом следует отметить отсутствие признаков деструкции кардиомиоцитов в ходе сеансов ПГГ в эти сроки. Очевидно, несмотря на выраженную артериальную гипоксемию и дефицит О 2 в тканях, повреждающее действие гипоксии ограничено продолжительностью периодов ПГГ и наличием периодов восстановления кислородного режима миокарда.

Результаты исследования показали, что уровень каталазы после однократного сеанса ПГГ увеличивается на 21,7 % (р≤0,05), глута-тион-S-трансферазы – в 2,8 раза (р≤0,05) при снижении СОД на 63,5 %. На 15–30-е сут адаптации активность СОД повышается при достоверно высоком уровне каталазы и глу-татион-S-трансферазы.

Полученные данные свидетельствуют, что курс ПГГ не только сопровождается усилением свободнорадикальных процессов и ПОЛ, но и способствует повышению активности системы антиоксидантной защиты, ко- торая является одним из компонентов увеличения специфической и неспецифической резистентности миокарда.

Заключение. В результате проведенных исследований установлено, что экспрессия Hif-1α, активность процессов ПОЛ, антиоксидантной защиты и структурных изменений в миокарде носят фазовый характер.

На ранних этапах адаптации (1-е сут) к ПГГ происходит аккумуляция Hif-1α, увеличение активности процессов ПОЛ, возникновение реактивных сосудистых изменений в миокарде. По мере увеличения сроков адаптации к ПГГ (15–30-е сут) снижается уровень экспрессии Hif-1α и активности ПОЛ, повышается активность ферментов антиоксидантной защиты, общее количество капилляров, улучшаются условия кровоснабжения и кислородного обеспечения миокарда.

Снижение экспрессии Hif-1α, повышение активности ферментов антиоксидантной защиты и сосудисто-тканевых отношений в миокарде по мере увеличения продолжительности курса ПГГ могут служить критерием морфофункциональной адаптации сердца к гипоксии.