Влияние протектора и блокатора тиоловых групп на регуляцию апоптоза опухолевых клеток при гипоксии

Согласно современным представлениям опухолевая прогрессия может быть связана с формированием гипоксии, приводящей к изменению редокс-статуса трансформированных клеток. Большое значение в поддержании редокс-статуса имеет система глутатиона, участвующая в регуляции внутриклеточной сигнализации, в том числе посредством глутатио-нилирования белков ион-транспортирующих систем.

Цель исследования. Изучение роли глутатионилирования белков в регуляции внутриклеточной концентрации ионов кальция и реализации апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии и модуляции редокс-статуса блокатором и протектором тиоловых групп.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши). Культивирование клеток осуществляли в полной питательной среде α -MEM в СО2-инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% СО2. Моделирование гипоксии проводили с помощью газовой смеси (5% О2, 5% СО2, 90% N2) в камере «Hypoxia Incubator Chamber». В качестве модуляторов редокс-статуса использовали N-этилмалеимид (NEM), необратимо связывающий SH-группы белков, и 1,4-дитиоэритритол (DTE), восстанавливающий окисленные SH-группы белков. Методом проточной цитометрии оценивали количество клеток, вступивших в апоптоз, и определяли внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Измерение концентрации белковосвязанного глутатиона проводили спектрофотометрическим методом. Результаты представляли в виде медианы (Ме) и квартилей (Q1-Q3). Достоверность различий оценивали с помощью непараметрических критериев Краскала-Уолиса и Манна-Уитни при р<0,05.

Результаты. В условиях гипоксии отмечалось усиление глутатионилирования белков в 3,5 раза по сравнению с нормоксией (р<0,05), что сопровождалось повышением внутриклеточной концентрации Са2+ в 1,3 раза (р<0,05) и увеличением количества клеток, вступивших в апоптоз в 4,1 раза (р<0,05). Образование смешанных дисульфидов между глутатионом и SH-группами остатков цистеина белковых молекул защищает последние от необратимого окисления и, согласно результатам ранее проведенных исследований, принимает участие в регуляции их активности, как один из механизмов посттрансляционной модификации. Добавление протектора тиоловых групп (DTE) при гипоксии приводило к снижению концентрации белковосвязанного глутатиона в 1,4 раза (р<0,05), что сопровождалось снижением содержания ионов кальция в цитоплазме опухолевых клеток линии Р19 в 1,1 раза (р<0,05). Воздействие блокатора тиоловых групп (NEM) не приводило к значимым изменениям в уровне глутатионилирования белковых молекул при гипоксии (р>0,05), что, по-види-мому, определяется его способностью связываться только со свободными SH-группами пептидов и белков. Однако, в этом случае значительно повышалась внутриклеточной концентрации Са2+ (в 3,0 раза (р<0,05)) и количество опухолевых клеток линии Р19, вступивших в апоптоз (в 9,1 раза (р<0,05)).

Заключение. Таким образом, редокс-опосредованное воздействие на ионтранспортирующие комплексы сопровождается изменением работы внутриклеточных сигнальных систем, в том числе с участием ионов кальция. Дизрегу-ляция кальциевого гомеостаза, в свою очередь, приводит к запуску программированной гибели опухолевых клеток. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем для разработки новых подходов в таргетной терапии опухолей.