Влияние растительного средства «Аркосител» на энергетический метаболизм почек белых крыс при ишемии/реперфузии

Функциональные нарушения почек могут быть различного генеза, среди которых не последнее место занимают ишемические повреждения, сопровождающиеся изменением биоэнергетических процессов, сниженной продукцией АТФ, нарушением кальциевого гомеостаза, повышенной генерацией свободных радикалов, окислительным стрессом и инициацией апопто-тических процессов. Накапливается все больше данных о роли дисфункции митохондрий в патофизиологии и лечении широкого спектра заболеваний. Таким образом, митохондрии в настоящее время рассматриваются как мишень для терапевтического вмешательства с целью восстановления их функций [7]. Возникло даже отдельное направление в медицине – биоэнергетическая фармакология [5], направленная на лечение и предупреждение поражения различных органов и тканей, связанных с митохондриальной дисфункцией.

Причинами прогрессирования хронических заболеваний почек может быть неконтролируемое употребление синтетических лекарственных препаратов, оказывающих нефротоксическое действие. По сравнению с ними средства растительного происхождения обладают низкой токсичностью, практически отсутствием побочных реакций при их длительном применении. Кроме того, фитосредства, содержащие целый комплекс биологически активных веществ, могут действовать на различные звенья патологического процесса, в том числе и на те, которые за- трагивают энергетический метаболизм клеток. В связи с этим наблюдается повышенный интерес к использованию средств растительного происхождения в профилактике и комплексной терапии почечной патологии.

Цель настоящей работы – изучение влияния комплексного растительного средства «Аркоси-тел» на энергетический метаболизм почек при их ишемии/реперфузии.

Материалы и методы. Объектом исследования послужило комплексное растительное средство, условно названное «Аркосител», состоящее из сухих экстрактов корней Scutellaria baicalensis Georgi, надземной части Arnica montana L., листьев Orthosiphon stamineus Benth., корней Comarum palustre L., корней Arctium lappa L. в соотношении 2:2:3:1:2. Технология получения экстрактов сухих заключалась в измельчении отдельных компонентов, экстракции спиртом этиловым (70% – S. baicalensis ; 60% – A. montana , – O. stamineus , – C. palustre ; 50% – A. lappa L.) с последующим концентрированием и вакуумной сушкой.

Исследования проведены на 40 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180–200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом эксперимента животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, воз- раста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986).

Животным опытной группы вводили внут-рижелудочно «Аркосител» в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней, крысам контрольной группы – внутрижелудочно дистиллированную воду в эквивалентном объеме по аналогичной схеме. Препаратом сравнения служил канефрон (BIONORICA AG) в изоэффективной дозе 30 мг/кг. На 6-е сутки моделировали двустороннюю 40-минутную ишемию (I) c последующей часовой реперфузией (R) почек по методу Kaushal et al. [8]. Выделение митохондрий из коркового слоя почек различных групп животных проводили по методу А.В. Панова [2].

Об энергетическом состоянии почек судили по содержанию внутриклеточного АТФ, концентрации пировиноградной и молочной кислот [1] и активности фермента пируваткиназы (ПК) [3] в гомогенате почек, а также по интенсивности окислительного фосфорилирования в митохондриях почек.

Функциональное состояние митохондрий оценивали полярографическим методом (поля-рограф «Эксперт-001») по скорости потребления кислорода в разных метаболических состояниях. В качестве субстрата дыхания использовали сукцинат в конечной концентрации 15 мМ. Окислительное фосфорилирование инициировали добавлением 150 µМ АДФ в инкубационную смесь объемом 1,0 мл. Изменение скорости потребления кислорода определяли в состояниях V4 0 , V3 и V4 1 (по Б. Чансу) цикла фосфорилирования добавленного АДФ. Для оценки энергетического статуса митохондрий рассчитывали коэффициенты стимуляции дыхания (СД=V3/V4 0 ) и сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О).

Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента с помощью пакета прикладных программ «Biostat – 2006». Различия между группами считали статистически значимыми при Р≤0,05.

Результаты и обсуждение. В таблице 1 представлены данные по влиянию «Аркоситела» на биохимические показатели, отражающие энергетический статус почек. Как следует из таблицы, при I/R происходит снижение содержания внутриклеточного АТФ на 48% по сравнению интактной группой животных. Одновременно отмечается повышение активности пиру-ваткиназы в контрольной группе животных, поскольку АТФ является аллостерическим ингибитором данного фермента [6]. С другой стороны, повышенная активность ПК в контрольной группе указывает на повышенную утилизацию глюкозы в гликолитическом пути. На фоне введения «Аркоситела» и препарата сравнения наблюдается снижение активности ПК, которая приближается к активности в интактной группе животных.

При профилактическом введении «Аркоси-тела» содержание АТФ в ишемизированных клетках повышается на 35% по сравнению с данными в контрольной группе. При введении канефрона содержание АТФ возрастало на 31% по сравнению контролем. Известно, что отношение лактат/пируват в норме не превышает 10/1 и указывает на баланс между анаэробным и аэробным дыханием [4]. Сдвиг этого отношения в сторону лактата (при разобщении окислительного фосфорилирования) говорит о переходе клеток ткани на анаэробный гликолиз, что характерно для гипоксических, ишемических состояний. Действительно, как видно из таблицы 1, при I/R почек содержание лактата возросло на 82%, а уровень пирувата снизился на 24% по сравнению с интактными значениями, при этом соотношение лактат/пируват в контрольной группе составило 24/1.

Таблица 1

Показатели	Группы животных
	Интактная n=10	Контрольная (I/R+Н 2 О) n=10	Опытная 1 (I/R+ «Аркосител») n=10	Опытная 2 (I/R+ канефрон) n=10
АТФ, мкмоль/г ткани	1,31±0,04	0,68±0,03*	0,92±0,03**	0,89±0,04**
Лактат,	1,73±0,09	3,15±0,14*	1,92±0,08**	2,12±0,08**

мкмоль/г ткани
Пируват, мкмоль/г ткани	0,169±0,008	0,128±0,004*	0,175±0,007**	0,177±0,006**
Лактат/Пируват	10,24±0,32	24,6±0,43*	10,97±0,27**	11,98±0,36**
Активность ПК, мкмоль/мин/мг белка	2,23±0,10	2,81±0,12*	2,43±0,09**	2,52±0,08**

Примечание . Здесь и далее * – различия статистически значимы по сравнению с интактом; ** – различия статистически значимы по сравнению с контролем при Р≤0,05.

Влияние «Аркоситела» на показатели энергетического состояния почек белых крыс при ишемии/реперфузии

Курсовое введение «Аркоситела» и канеф-рона способствовало снижению данного соотношения в ишемизированных органах до 11/1 и 12/1 соответственно. Это указывает на процесс частичного восстановления окислительного фосфорилирования в результате нормализации редокс-состояния клеток.

Для того чтобы подтвердить предположение о том, что «Аркосител» восстанавливает процессы окислительного фосфорилирования, нами проведена оценка окислительного фосфорилирования в митохондриях почек в интактной, контрольной и опытных группах при I/R (таблица 2).

Таблица 2

Параметры дыхания митохондрий	Группы животных
	Интактная n=8	Контрольная (I/R+Н 2 О) n=8	Опытная 1 (I/R+ «Аркосител») n=8	Опытная 2 (I/R+ канефрон) n=8
V3	12,05±0,33	7,14±0,22*	10,12±0,57**	9,42±0,15
V4 1	3,14±0,21	2,42±0,26	3,71±0,17**	2,71±0,11**
V4 о	3,11±0,17	2,53±0,13	2,89±0,13**	2,57±0,10**
CД	3,87±0,26	2,82±0,14	3,50±0,11**	3,66±0,14**
ADP/О	1,66±0,10	0,97±0,07*	1,50±0,11**	1,19±0,17

Примечание. Размерности единиц скорости дыхания (V 4п , V 3 , V 4o ) – nmol О 2 /мин/мг белка митохондрий.

Влияние «Аркоситела» на интенсивность окислительного фосфорилирования в митохондриях почек белых крыс при I/R

Как следует из таблицы, I/R приводила к существенному снижению энергопродукции в митохондриях почек. Так, скорость дыхания в состоянии окислительного фосфорилирования V3 при окислении сукцината снижалась в 1,7 раза по сравнению с показателями у интактных животных. Скорость дыхания в состоянии V4 1 и V4 0 снижалась в среднем на 23%.

На фоне курсового введения «Аркоситела» скорость V3 повышалась на 42%, а при введении канефрона – на 32% по сравнению с контролем.

Индекс сопряженности окислительного фосфорилирования (AДФ/О) при I/R снижался на 42% по сравнению с интактом. При введении исследуемого фитосредства происходило повышение коэффициента сопряженности AДФ/O на 55%. Коэффициент стимуляции дыхания (СД=V3/V40) в контроле уменьшался на 27% по сравнению с интактом, а после курсового введения исследуемого средства и препарата сравне- ния коэффициент стимуляции дыхания повышался на 24 и 30% соответственно (табл. 2).

Вероятнее всего восстановление окислительного фосфорилирования связано с нормализацией окислительно-восстановительного баланса клетки, обусловленного выраженными антиоксидантными свойствами исследуемого фитосредства. Не исключено, как показано в работе Trumbeckaite et al. [9], что биологически активные вещества могут непосредственно влиять на активность составляющих фосфорилирующей системы, таких как F 1 F 0 ATPаза и/или ATФ/AДФ транслокатор, а также активировать комплексы дыхательной цепи переноса электронов.

Суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что исследуемое фитосредство «Аркосител» обладает энергопротекторным действием и усиливает интенсивность дыхания митохондрий при I/R почек.

С.А. Чукаев . Oценка фармакотерапевтической эффективности мексидола в качестве средства коррекции гипоксических, ишемических и реоксигенационных повреждений