Влияние растительных средств на процессы апоптоза в почках и печени белых крыс

Апоптоз, или программируемая клеточная смерть (ПКС), является важным клеточным процессом, контролирующим развитие и гомеостаз многоклеточного организма. Каждая отдельная клетка в пределах специализированной ткани должна гармонично взаимодействовать как с окружающими ее клетками, так и с организмом в целом. Любая поломка в этом сложном регулирующим механизме ведет к нарушению нормального гистогенеза и функционирования клеточных структур, что может быть причиной многих заболеваний человека. Например, избыточная ПКС нарушает рост и развитие организма, является причиной нейродегенеративных заболеваний и синдрома приобретенного иммунодефицита. С другой стороны, чрезмерное подавление апоптоза может служить причиной развития аутоиммунных болезней и рака [1].

Существует множество как эндогенных, так и экзогенных факторов, толкающих клетку на путь апоптоза. Это так называемые факторы смерти. Не вдаваясь в подробности молекулярных механизмов развития апоптоза, отметим, что наряду с летальными факторами, такими как различные цитокины и медиаторы воспалительного процесса, имеются также факторы выживания клетки, например, внеклеточный матрикс и EGF (эпидермальный фактор роста), которые препятствуют развитию апоптоза в клетках проксимальных канальцев почек, эндотелиальных и мезенгиальных клетках. Здесь важно, что судьба клетки будет зависеть от сбалансированности факторов выживания и факторов, индуцирующих апоптоз. В связи с проблемой, вынесенной в заглавие статьи, нас больше интересуют экзогенные факторы апоптоза. К ним в первую очередь можно отнести факторы инфекционной, вирусной, токсической природы, гипоксию, ишемию/реперфузию и тепловой шок. В зависимости от интенсивности и длительности действия этих факторов клетку ожидает либо патологическая смерть (некроз), либо ПКС (апоптоз). В отличие от апоптоза, который протекает и в нормальном физиологическом состоянии организма, и в состоянии болезни, некроз происходит, только если клетки или ткани подвергаются сильному и острому повреждению [2].

В настоящее время установлено, что различные эндогенные и экзогенные повреждающие факторы приводят к развитию окислительного стресса, характеризующегося повышенным образованием активных форм кислорода. Активация процессов свободнорадикального окисления является инициирующим и/или поддерживающим фактором многих патологических состояний организма. Одним из ответов клетки на стресс является более ранний запуск процессов апоптоза – программируемой гибели клетки. Клетки, находящиеся в состоянии апоптоза, теряют функциональную состоятельность, что оказывает влияние на функции органа в целом. Анализ особенностей патогенеза некоторых состояний, таких как острая почечная недостаточность ишемической и токсической природы или токсическое поражение клеток печени, связано с индукцией апоптотического процесса [1, 2]. Это очень важное наблюдение, поскольку в отличие от некроза апоптоз поддается регулированию на определенных его стадиях.

В настоящее время отмечается заметный переход от описания явления программированной клеточной смерти к подробному изучению ее механизмов и способов управления этими механизмами. Среди биохимических событий, ведущих к апоптотическим изменениям, важное место занимает активация каспаз, поскольку с ними связаны многие биохимические и морфологические признаки апоптоза. Каспаза-3 является ключевым медиатором ПКС в различных типах клеток [2]. Известно, что пептидные ингибиторы каспаз эффективно препятствуют развитию апоптотического процесса как in vitro,так и in vivo. Что касается ингибиторов апоптоза природного (растительного) происхождения, то такие сведения в современной литературе практически отсутствуют. Наиболее яркие примеры – это выраженное ингибирующее действие экстракта egb761 из Ginkgo biloba на апоптоз «митохондриального» происхождения [3] и ингибирующее действие кофейной кислоты на активность каспазы-3 в гранулированных нейронах мозжечка, подверженных токсическому апоптозу [4]. Исследования на нокаут-мышах по гену каспазы-3 указывают на то, что этот фермент может являться целью терапевтического вмешательства при заболеваниях, связанных с избыточным апоптозом. Например, было показано, что ингибирование активности каспазы-3 защищает клетки головного мозга и почек от ишемических повреждений в модельных экспериментах на крысах [1, 2].

Таким образом, выяснение роли апоптоза в развитии патологических процессов и поиск новых средств, особенно средств природного происхождения, способных оказывать регулирующее действие на процессы индуцированного апоптоза, является актуальной проблемой биологии и медицины.

Цель настоящей работы – изучить влияние комплексных растительных средств «Нефрофит» и «Гепатон» на процессы индуцированного апоптоза на основе анализа активности каспазы-3, одного из ключевых ферментов, наилучшим образом коррелирующего с апоптотическим фенотипом при ишемических повреждениях почек и токсических повреждениях печени белых крыс линии Wistar.

Материалы и методы

Опыты проведены на белых крысах обоего пола линии Wistar массой 180-200 г. Апоптоз индуцировали ишемией/реперфузией почек по методу [5]. После 40-минутной окклюзии почечной артерии кровоток восстанавливали снятием зажимов. Продолжительность реперфузии составляла 1, 4, 8 и 16 часов. Активность каспазы-3 определяли в гомогенате коркового слоя почек колориметрическим методом согласно рекомендациям к набору реактивов (Caspase-3 Assay Kit, Sigma) в трех группах животных: в ложнооперированной, в группе с индуцированным апоптозом (контроль) и в группе животных на фоне введения «Нефрофита» (опыт). В каждой группе было по 7 крыс. Водный раствор фитосредства вводили животным внутрижелудочно в экспериментально-терапевтической дозе 150мг/кг в объеме 10 мл/кг за 16 часов и за 1 час до ишемии.

Комплексное растительное средство «Нефрофит» представляет собой смесь из экстрактов листьев толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva ursi L.), листьев ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.) и травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.) в соотношении 4:4:2.

Токсическое повреждение печени вызывали однократным внутрижелудочным введением 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода (CCl 4 ) в дозе 1,25 мл/кг. Животным опытной группы «Гепатон» вводили внутрижелудочно в экспериментально-терапевтической дозе 50мг/кг в объеме 10мл/кг за 16 часов и за 1 час до введения раствора тетрахлорметана. Крысы контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Активность каспазы-3 определяли вышеуказанным методом в гомогенате печени через 1, 4, 12 и 24 часа после введения четыреххлористого углерода.

«Гепатон» представляет собой фитосбор из цветков ромашки аптечной (Matricaria recutita L. ) - 1 часть, листьев мяты перечной (Mentha piperita L.) – 1 часть, плодов шиповника (Rosa sp . ) – 3 части, плодов боярышника (Crataegus sp . ) – 2 части, травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) – 1 часть, корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch . ) – 1 часть, корневищ и корней девясила высокого (Inula helenium L . ) – 1 часть.

Указанные средства выбраны в качестве возможных ингибиторов активности каспазы-3 на том основании, что они, как было нами ранее установлено, обладают выраженными нефропротекторным и гепатопротекторным свойствами, а также выраженной антиоксидантной и мембраностабилизирующей активностью [6].

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при Р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

Как видно из таблицы 1, активность каспазы-3 в контрольной группе животных с индуцированным апоптозом в почках увеличивалась по сравнению с интактными крысами в 3 раза после часовой реперфузии, в 7,3 раза после 4-часовой и более чем в 15 раз через 8 и 16 часов реперфузии. В опытной группе животных под влиянием «Нефрофита» происходило снижение активности каспазы-3, сравнимое с действием специфического ингибитора этого фермента Ac-DEVD-CHO. Через 1 час реперфузии почек активность фермента у крыс опытной группы снижалась на 53%, через 4 – на 42%, через 8 – на 41% и через16 часов на 20% по сравнению с контролем. Уменьшение ингибирующего влияния «Нефрофита» на активность указанного фермента, вероятно, объясняется его биотрансформацией и/или элиминацией из организма животных.

Таблица 1

Активность каспазы-3 при ишемических повреждениях почек в различных группах животных

Условия эксперимента	Активность каспазы-3 пмоль/мин/мг белка
	1 час	4 часа	1       8 часов		16 часов
Ложнооперированная группа	2,40±0,13
Контрольная группа	7,19±1,04	14,77±1,18		36,60±3,05	36,20±2,46
Контрольная группа + Ac-DEVD-CHO	4,36±0,34	5,030±1,31		14,00±1,56	19,60±2,83
Опытная группа + «Нефрофит»	3,36±0,23*	8,56±1,75*		21,50±1,10*	29,10±2,21

Примечание: здесь и далее *- различия в группах контроль – опыт достоверны при P≤0,05

Таким образом, установлено ингибирующее влияние комплексного растительного средства «Нефрофит» на активность каспазы-3. Снижение активности данного протеолитического фермента коррелировало с улучшением показателей функционального состояния почек. Витральными методиками ранее было показано, что под влиянием нефропротекторного средства увеличивается активность пи-руваткиназы более чем 2 раза, снижается активность К+ и, в основном, Na+-АТФаз, что способствует сохранению энергетического баланса клеток нефронов при ишемии/реперфузии почек. Содержащиеся в «Нефрофите» флавоноиды и тритерпеноиды могут регулировать транскрипционную активность генов, кодирующих супероксиддисмутазу, глутатион пероксидазу, глутатион синтазу и другие белки, повышающие антиоксидантный статус клетки и снижающие количество повреждений в ДНК, что приводит к повышению жизнестойкости клеток.

В отдельном исследовании (данные не приведены) было установлено, что «Нефрофит» обладает «энергосберегающим» действием при ишемии почек. Возможны два механизма этого явления: первый – активация анаэробного гликолиза в период ишемии и начальных этапов реперфузии, второй – более экономичный расход энергии за счет подавления активности АТФаз. Например, было показано, что предварительное введение глюкозы при ишемии/реперфузии почек крыс приводит к более быстрому восстановлению уровня АТФ и снижению активации проапоптотического белка Bid [2].

Данные по влиянию «Гепатона» на активность каспазы-3 в гепатоцитах при остром токсическом повреждении печени CCl 4 представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние «Гепатона» на активность каспазы-3 в клетках печени крыс при тетрахлорметановом гепатите

Группы животных	Активность каспазы -3, пмоль/ мин/мг белка
	1 час	4 часа	1        12 часов		24 часа
Интактная	16,68 ± 3,56
Контрольная (ССL4)	15,23 ± 1,27	28,69±4,15		38,42±1,39	38,98 ± 3,03
Контрольная + ингибитор	8,94 ± 1,53*	22,19±5,41		21,60±3,91*	23,65 ± 1,46*
Опытная (ССL4 + «Ге-патон»)	7,24 ± 1,59*	29,51±3,76		39,87±3,53	33,75 ± 2,40

Из таблицы 2 следует, что через 1 час после введения раствора тетрахлорметана активность фермента статистически не отличается от данных у животных интактной группы (15.23 ± 1.27 и 16.68 ± 3.56 соответственно), максимальная активность каспазы-3 в клетках печени наблюдали через 12 и 24 часа после введения четыреххлористого углерода животным, что обьясняется динамикой накопления CCl4 в печени. Введение крысам «Гепатона», обладающего гепатопротекторной и антиоксидантной активно- стью, не оказывало ингибирующего действия на активность каспазы-3. Возможно, это связано с тем, что тетрахлорметан главным образом вызывает ранний и выраженный некроз гепатоцитов и только отчасти - их апоптоз, переходящий во вторичный некроз. Хотя под влиянием «Гепатона» отмечалось улучшение показателей функционального состояния печени у животных опытной группы, а также снижение показателей уровня окислительного стресса. Ранее было установлено, что «Гепатон» не влияет на активность пируваткиназы и, таким образом, в отличие от «Нефрофита», не содействует восполнению дефицита энергии, который является одной из причин вступления клетки в апоптоз, а при дальнейшим снижении пула АТФ – в некроз.

Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что наличие одних только антиоксидантных свойств недостаточно для снижения уровня индуцированного апоптоза. Необходимо также, чтобы испытуемые средства обладали способностью восстанавливать нарушенный энергетический баланс клетки, так как скорость и глубина апоптотического процесса зависят от степени истощения запасов АТФ [2].

В заключение следует еще раз подчеркнуть, что при тетрахлорметановом повреждении печени главным образом присходят некроз гепатоцитов и их частичный апоптоз с последующим вторичным некрозом, при котором также отмечается резкое повышение активности каспазы-3. Видимо, поэтому не удалось обнаружить ингибирующего действия «Гепатона» на активность фермента независимо от того, обладает «Гепатон», подобно «Нефрофиту», энергосберегающим действием или нет. Хотя в первом случае мы вправе были ожидать менее выраженные повреждения печени. Для более определенных суждений и выводов необходимо изучить влияние «Гепатона» на динамику АТФ в нормальной печени и в печени с индуцированным апоптозом.