Влияние различных групп синтетических пестицидов на развитие, выживаемость и антагонистическую активность некоторых видов аэробных спорообразующих бактерий

темы защиты в современном растениеводстве, призванный существенно снизить дозы применения химических препаратов [7-8]. Эффективность комбинированного применения биопрепаратов совместно с пестицидами во многом зависит от устойчивости их биологической составляющей к действующим веществам химических препаратов.

В связи с этим, при разработке биопрепаратов на основе новых штаммов бактерий-антагонистов оценка их резистентности к синтетическим пестицидам должна стать существенным критерием их отбора. Важным является и мониторинг индивидуальной чувствительности и совместимости компонентов уже существующих биопрепаратов с различными классами пестицидов, что позволит разработать скоординированный подход при совместном применении известных биологических и химических препаратов в интегрированной системе защиты растений.

Бактерии-антагонисты, относящиеся к родам Bacillus и Paenibacillus , широко используются в качестве основы многих биопрепаратов для защиты растений [9], однако сведения об их устойчивости к пестицидам остаются достаточно фрагментарными и малоизученными, равно как и оценка специфики влияния различных классов химических средств на таксономически близкие и удаленные виды этих бактерий [10].

Целью настоящей работы являлось изучение влияния ряда широко используемых в растениеводстве синтетических пестицидов, в т.ч. гербицидов и фунгицидов, на рост и выживаемость некоторых видов бацилл-антагонистов и продукцию ими анти-грибных соединений in vitro .

Практическая задача работы состояла в оценке перспектив и эффективности типовых представителей бактерий-антагонистов и препаратов на их основе в условиях комбинированного применения с различными химическими препаратами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве тест-объектов исследований использовали различные штаммы бацилл-антагонистов из коллекции ИБ УНЦ РАН, в том числе Bacillus subtilis ИБ-54, Paenibacillus ehimensis ИБ-739 и P. polymyxa ИБ-37, депонированные во Всероссийских коллекциях микроорганизмов и показывающие различную степень антагонистической активности к фитопатогенным грибам и отличающиеся по механизму защитного действия на растения. Бактериальные штаммы поддерживали на картофельном агаре (КА) при 37^оС в течение 2-4 сут после засева, после чего хранили при комнатной температуре. Оценку антагонистической активности исследуемых штаммов проводили в отношении гриба – возбудителя корневой гнили злаковых Bipolaris sorokiniana Sacc. Shoemaker из коллекции ИБ УНЦ РАН. Степень подавления гриба оценивали методом диффузии в агар.

В качестве тестируемых гербицидов использовали растворимые в воде и полярных органических растворителях известные препаративные формы и действующие вещества, включая гранстар – коммерческий препарат на основе трибенуронметила (75% д.в.), глифосат, 2,4-Д (2,4-дихлорбензойная кислота), дикамба, клопиралид. В работе тестировали также препаративные формы и комбинированные препараты фунгицидов, применяемых в сельском хозяйстве, в том числе соединения триазолового ряда, включая пенконазол, тебуконазол (раксил), дифеноконазол (скор) и азарол (триади-мефон). Из комбинированных препаратов использовали коммерческий «Профит Голд», содержащий по 25% д.в. цимоксанила (1-(2-метоксимино-2-цианацетил)-3-этилмочевина) и фамаксадона, соответственно. Влияние пестицидов на рост бактерий изучали по изменения оптической плотности и титра бактериальной популяции после 1-2 сут культивирования в жидкой питательной среде в присутствии тестируемых препаратов. Бактерии предварительно культивировали в течение 18-24 ч в жидкой питательной среде следующего состава (г/л):

KH 2 PO 4 , 1,0; K 2 HPO 4 *3H 2 0, 0,5; (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0,5; MgSO 4 *7H 2 O, 0,2; пептон ферментативный, 3,0; дрожжевой экстракт, 3,0; кукурузный экстракт, 3,0; глицерин, 5,0. Культивирование проводили в конических колбах объемом 250 мл на качалке УВМТ-12-250 при 36,5±0,5^◦С и 165 об/мин. Ночную культуру вносили по 1 мл на 50 мл жидкой питательной среды того же состава. В опытные варианты вносили растворы пестицидов в стерильной дистиллированной воде для выявления степени роста бактерий в интервале концентраций, рекомендуемых для обработки растений в полевых условиях: гранстар – 0,008-0,024%; 2,4 – Д – 0,3-0,6%; глифосат – 0,51,0%; дикамба –0,024-0,037%; клопиралид – 0,10,2%; тебуконазол –0,24-0,3%; профит голд – 0,040,12%. Интенсивность развития бактерий в культуральной среде регистрировали на 1-е и 2-е сут культивирования по светорассеянию на спектрофотометре СФ-46 при 630 нм. В тестах на выживаемость для споровых культур использовали верхние пределы концентраций пестицидов: гранстар -0,024%; 2,4 – Д – 0,6%; глифосат – 2%; дикамба – 0,037%; клопиралид – 0,1%; тебуконазол – 0,3%; профит голд – 0,12%; азарол – 0,1%; дифеноконазол – 0,25%; пенконазол – 0,2%. В образцы добавляли по 1 мл 24-ч КЖ, 1 мл раствора пестицида и 8 мл 0,85% физиологического раствора. В контрольный образец вносили 1 мл 24-ч КЖ бактерий и 9 мл физиологического раствора. Образцы инкубировали 24 ч при комнатной температуре, затем высевали на титр на КА.

Эксперименты проводили в 3-кратной повторности. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin 7.0 Pro и Excel-2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При испытании in vitro препаративных форм гербицидов и фунгицидов штаммы B. subtilis ИБ-54 и P. ehimensis ИБ-739 проявляли более высокую стабильность по сравнению со штаммом P. po-lymyxa ИБ-37, что, возможно, отчасти связано с их более высокой скоростью роста (рис. 1).

Рис. 1. Кривые устойчивости B. subtilis ИБ-54 к рекомендуемым верхним и нижним пороговым концентрациям некоторых синтетических пестицидов, используемым для обработки в полевых условиях.

Рост двух первых штаммов резко снижался в присутствии 2,4-Д, глифосата и, отчасти, тебукона- зола, тогда как развитие P. polymyxa не испытывало влияния только со стороны препаратов Гранстар (трибенуронметил) и Профит Голд. Следует отме тить, что среди гербицидов дикамба, а среди фунгицидов Профит Голд при своей нижней пороговой концентрации даже активировали рост B. subtilis на

33% и 28%, соответственно, тогда как при верхней пороговой концентрации их действие носило угне- тающий характер (снижение роста на 4,4% и 48%, соответственно) (рис. 2). Стимулирующее влияние на B. subtilis было отмечено также для препарата

Гранстар и клопиралида (24% и 19% соответственно).

* ti> / 4?  01»

X X Z

-♦“Р polymyxaИБ-37,48-часовая культура

---Р elmneiuis ИБ-739, 24часовая культура

---Контроль В subtilis ИБ-

54,24-часовая культура

Рис. 2. Сравнительная устойчивость антагонистических штаммов различных таксономических групп бацилл к верхней пороговой концентрации некоторых коммерческих препаратов гербицидов и фунгицидов.

Известна способность некоторых гербицидов стимулировать рост бактерий. В частности такая активность была выявлена у нитралина в опыте с Pseudomonas fluorescens [11]. Среди тестируемых гербицидов в наибольшей степени рост B. subtilis подавляли 2,4-Д и глифосат, при этом снижение титра бактерий составляло 98 и 96%. Штамм P. polymyxa ИБ-37 проявлял наибольшую чувствительность к действию большинства гербицидов, интенсивность роста этой культуры в присутствии всех препаратов снижалась в среднем на 80-95% (рис. 2). Таким образом, в плане пестицидной устойчивости бактерии B. subtilis в данных условиях были более резистентными. При этом рост всех групп бактерий резко подавлялся в присутствии 2,4-Д и глифосата. В целом кривые влияния гербицидов на штаммы различных таксономических групп бацилл имели сходный характер.

При оценке влияния пестицидов на антигриб-ную активность (уровень продукции антигрибных соединений) бацилл-антагонистов in vitro в качестве основного тест-объекта использовали наиболее устойчивый штамм B. subtilis ИБ-54. Для этого надосадочную жидкость, полученную из культуральной среды штамма после 24 ч культивирования в присутствии различных химических препаратов оценивали на степень подавления фитопатогенного гриба B. sorokiniana (рис. 3). Как видно из рис. 3, синтез активных соединений изучаемым штаммом резко снижался в присутствии 2,4-Д и глифосата вследствие подавления его роста и гибели большей части клеток. Значительное повышение антигриб-ной активности вторичных метаболитов B. subtilis ИБ-54 в присутствии нижней пороговой концентрации таких гербицидов, как клопиралид и дикам-ба, и верхней пороговой концентрации препарата Гранстар могло объясняться более интенсивным ростом штамма в этих условиях, как было обнаружено ранее. Микроскопия 24-ч культуры B. subtilis ИБ-54 подтвердила низкую чувствительность его клеток к клопиралиду. В присутствии 0,04% препарата Профит Голд (по 25% д.в. фамаксадона и ци-моксанида) наблюдалось почти 2-кратное повышение антигрибной активности B. subtilis ИБ-54, которое может быть связано как с увеличением интенсивности роста бактерий в этих условиях, так и дополнительным фунгицидным эффектом самого препарата, присутствующего в культуральной среде. С другой стороны, при верхней пороговой концентрации Профит Голд (0,08%) наблюдалось заметное снижение роста и активности штамма, что ставит под сомнение аддитивный эффект этого препарата (рис. 3). Это подтверждалось и при оценке влияния другого синтетического фунгицида - тебуконазола, который сильно снижал рост и ан-тигрибную активность B. subtilis ИБ-54, не оказывая дополнительного собственного эффекта на B. sorokiniana.

i i +клопиралид, 0,02%

।* +клопиралид, 0,01% i—|—। +Фамаксадон и цимоксанид, 0,08%

+Фамаксадон и цимоксанид, 0,04% нф

+роксацин, 0,5 мл/л КЖ ф +тебуконазол, 0,30% нф +тебуконазол, 0,24%

-ф —। +дикамба, 0,037%

1----1----1 +дикамба, 0,024% ф +глифосат, 1,0%

¹—Я —¹ +глифосат, 0,5%

।—| —। +2,4-Д, 0,060%

---1 +2,4-Д, 0,030%

Ф +Трибенуронметил (Гранстар), 0,024%

।----1 ----1 +Трибенуронметил (Гранстар), 0,008%

।    |-----1 Контроль B. subtilis ИБ-54

—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I 0         200        400        600        800        1000

Средняя площадь зоны подавления развития Bipolaris sorokiniana вокруг лунки с 0,1 мл супернанта КЖ

Рис. 3. Влияние внесения синтетических гербицидов и фунгицидов на антигрибную активность внеклеточных метаболитов 24-часой культуры B. subtilis ИБ-54.

Как показали полученные результаты оценки выживания споровой культуры бацилл-антагонистов при инкубации в присутствии синтетических гербицидов/фунгицидов и в условиях отсутствия активного роста, эндоспоры большинства штаммов показывали существенно более высокую устойчивость в сравнении с вегетативными клетками. Однако, следует отметить, что как и в случае активного роста бактерий, наибольшее влияние на выживаемость споровых культур оказывали 2,4-Д и глифосат. Инкубация в течение суток при комнатной температуре в присутствии этих препаратов приводила к снижению титра споровых культур различных штаммов в среднем на один порядок (рис. 4). Наименьшую индивидуальную чувствительность к этим препаратам проявлял штамм P. ehimensis ИБ-739.

Рис. 4. Влияние синтетических гербицидов и фунгицидов на споровую культуру бацилл-антагонистов

Наименьшим бактерицидным действием на эндоспоры всех тестируемых штаммов характеризовались фунгцидные препараты - Профит Голд, Азарол (триадимефон), дифеноконазол и пенкона- зол (рис. 4). Полученные результаты свидетельствуют об относительной устойчивости споровых культур бацилл к большинству испытанных пестицидов, за частичным исключением 2,4-Д и глифо- сата, что демонстрирует возможность эффективного применения биопрепаратов на основе споровой культуры наиболее активных штаммов совместно с протравителями и гербицидами в комплексной защите растительных культур. Однако для оценки эффективности комбинированного применения синтетических фунгицидов с биопрепаратами была необходима дальнейшая проверка их совместного действия на фитопатогенные грибы in vitro.