Влияние репродуктивных гормонов на основные функции нейтрофилов человека

“ Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Изучена способность эстрадиола, прогестерона и хорионического гонадотропина модулировать фагоцитарную и окислительную активность нейтрофилов периферической крови небеременных женщин. Гормоны вносили в пробы по отдельности и в физиологических сочетаниях, характерных для 1 и III триместров беременности. Установлено увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов в присутствии высокой (100 МЕ/мл) дозы хорионического гонадотропина, а также сочетаний стероидных гормонов, соответствующих их уровням в крови как в I, так и в III триместре беременности. Люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов также достоверно усиливается комбинацией стероидных гормонов, характерной для III триместра беременности. Таким образом, гормоны репродукции обладают способностью стимулировать нейтрофильный фагоцитоз и повышают окислительный потенциал как интактных, так и активированных нейтрофилов. Учитывая, что данный стимулирующий эффект экстраполируется на III триместр беременности, можно предполагать «заинтересованность» основных гормонов репродукции в подготовке клеток неспецифической резистентности к активации родовой деятельности.

Процесс гестации является феноменом естественной трансплантации полуаллогенного плода, так как генофонд зиготы наполовину заимствован от отца. Однако при нормальном течении беременности отторжения эмбриона не происходит. Нейтрофилы - основные клеточные эффекторы неспециг фической защиты организма, принимающие активное участие не только в элиминации патогенов, но и в трансплантационных реакциях. Обладая высокой реактивностью в ответ на действие хемотаксических и других факторов, эти клетки первыми появляются в очаге поражения и определяют пусковые механизмы развития воспаления и ранних защитных реакций (Потапнев, 1995; Белова, 1997; Haslett et al., 1989). Как известно, гормоны репродукции могут эффективно воздействовать на пролиферацию и дифференцировку не только репродуктивных тканей, но и клеток иммунной системы, контролирующих антигенный гомеостаз материнского организма (Ширшев, 2002). Важную роль в регуляции иммунной системы при беременности играют женские половые стероидные гормоны - эстрогены и прогестины, а также индуктор их синтеза - хорионический гонадотропин (ХГ) (Ширшев, 1998, 2002). В настоящее время, несмотря на многочисленные исследования, проведенные в области иммунологии репродукции, остается невыясненным вопрос о механизмах, обеспечивающих гормональную регуляцию нейтрофилов в период физиологически развивающейся беременности у человека.

Цель настоящей работы - оценка функциональной активности нейтрофилов человека в присутствии различных комбинаций репродуктивных гормонов, уровень которых соответствует различным триместрам беременности.

Материалы и методы исследования

Исследование проводилось in vitro. Гормоны использовали в концентрациях, соответствующих их уровням в периферической крови в I и III триместрах беременности: ХГ - 100 и 10 МЕ/мл, эстрадиол (Е2) - 1 нг/мл и 10 нг/мл, прогестерон (Рг) - 20 нг/мл и 100 нг/мл соответственно. При этом гормоны вносили в пробы по отдельности и в физиологических сочетаниях, соответствующих разным триместрам беременности (Вихляева, 1998). Нейтрофилы выделяли из периферической крови небеременных женщин репродуктивного возраста центрифугированием при двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Плотности верхнего и нижнего градиентов составляли 1,077 и 1,112 г/см3 соответственно. Нейтрофилы собирали с нижней интерфазы (Crouch, Fletcher, 1992). Фагоцитарную активность оценивали по поглощению частиц полистирольного латекса (1,5 мкм). Для этого в клеточную культуру плотностью 4106клеток/мл и объемом 0,1 мл вносили гормоны, в контрольные пробы - среду 199. Пробы инкубировали в течение 1 ч при 37°С, после чего добавляли латексные частицы (4108/мл). По истечении 1,5-часовой инкубации готовили мазки, которые

фиксировали метанолом и окрашивали по методу Романовского-Гимза. Подсчет клеток вели под масляной иммерсией с использованием светового микроскопа «Биолам». Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по двум показателям: 1) процент фагоцитоза - число фагоцитирующих нейтрофилов на 100 клеток; 2) фагоцитарный индекс, отражающий уровень индивидуальной поглотительной способности клеток. Окислительную активность оценивали по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) нейтрофилов, стимулированных латексными частицами. Хемилюминесцентный анализ проводили с помощью биолюмино-метра БЛМ-8703М. Для этого в пластиковую кювету вносили 800 мкл раствора, содержащего НО мМ NaCl, 10 мМ трис-НС1, 2,5 мМ MgCl₂, 5 мМ глюкозы и 10"⁴М люминола (pH 7,4). После инкубации в течение 3-5 мин при 37°С и замера фонового свечения добавляли 50 мкл клеточной суспензии (4-10⁶/мл), предварительно инкубированной с гормонами в течение 1 ч, измеряли интенсивность спонтанной хемилюминесценции. Затем в кювету вносили 50 мкл латексных частиц в концентрации 410⁸/мл и фиксировали интенсивность стимулированной хемилюминесценции до того момента, когда, пройдя максимум, показатель снизится на 2/3.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием /-критерия Стьюдента и корреляционного критерия Пирсона.

Результаты и их обсуждение

В ходе исследования выявлено увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов в присутствии высокой дозы ХГ (100 МЕ/мл), характерной для крови I триместра беременности, а также при сочетаниях стероидных гормонов, соответствующих как I, так и III триместрам беременности. Интересно отметить, что при совместном действии ХГ и стероидов статистически значимых изменений нейтрофильного фагоцитоза не выявляется (табл. I). Поглотительная активность нейтрофилов (фагоцитарный индекс) также увеличивается в присутствии гонадотропина в высокой концентрации и при комбинации стероидов, характерной для I триместра беременности. Эффекта от совместного действия всех трех гормонов не наблюдается, как и при исследовании процента фагоцитоза.

Таким образом, гонадотропин в концентрации 100 МЕ/мл повышает как процент нейтрофильного фагоцитоза, так и поглотительную активность этих клеток, в то время как Е2 или Рг не дают эффектов. При совместном действии различные комбинации доз половых стероидов, как и ХГ, Достоверно стимулируют фагоцитоз нейтрофилов. Однако совместное действие всех трех гормонов не влияет на фагоцитарную активность гранулоцитов. По-видимому, негеномные эффекты половых стероидов, которые реализуются на уровне вторичных мессенджеров и факторов транскрипции, конкурируют с аналогичными мессенджерами, индуцируемыми ХГ в нейтрофилах. Очевидно, поэтому при беременности не отмечается явных изменений в фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови (Ширшев, 1999).

Таблица 1

Влияние репродуктивных гормонов на фагоцитоз латексных частиц нейтрофилами человека

№ группы	Экспериментальное воздействие	Показатели фагоцитоза (М± ш)
		Процент фагоцитоза	Фагоцитарный индекс
1 .	Контроль	48,09 ± 6,477	3,36 ±0,635
2	ХГ, 100 МЕ/мл	56,18 ± 7,846*	3,90 ± 0,727*
3	ХГ, 10 МЕ/мл	48,45 ± 7,826	3,36 ± 0,625
4	Эстрадиол, 1,0 нг/мл	52,45 ±8,112	2,86 ±0,531
5	Эстрадиол ,10 нг/мл	46,73 ± 7,678	3,79 ± 0,852
6	Прогестерон, 20 нгЛчл	51,46 ±7,267	4,15 ±0,976
7	Прогестерон, 100 нг/мл	46,27 ± 8,556	4,08 ±0,931
8	Эстрадиол, 1,0 нг/мл + ХГ, 100 МЕ/мл + прогестерон, 20 нг/мл	52,82 ±8,714	4,46 ± 0,852
9	Эстрадиол, 10 нг/мл + ХГ, 10 МЕ/мл + прогестерон 100нг/мл.	55,55 ± 9,940	4,56 ± 1,104
10	Эстрадиол, 1,0 нг/мл + прогестерон, 20 нг/мл	59,27 ±8,564*	5,17± 1,128*
11	Эстрадиол, 10 нг/мл + прогестерон, 100 нг/мл	62,09 ±8,464*	4,70 ± 1,122

Примечание: * - Р<0,05 (сопоставление с контролем).

При оценке гормонального контроля кислород-зависимых механизмов микробицидности нейтрофилов установлено, что как ХГ, так и Е2 не оказывает значимых воздействий на различные варианты ЛЗХЛ. Из всех исследуемых гормонов только Рг обладает способностью активировать латекс-стимулированную ЛЗХЛ нейтрофилов (табл. 2). Спонтанная ЛЗХЛ нейтрофилов достоверно усиливается лишь при использовании комбинации доз стероидных гормонов, экстраполированной с уровня их концентраций в крови в III триместре беременности. Не исключено, что в данном случае Е2 выступает коактиватором Рг, поскольку известно его пермессивное действие в отношении прогестагенов (Йена, Джаффе, 1998). Как видно из табл. 2, при добавление ХГ к комбинации стероидов данный эффект сохраняется. Латексстимули-рованная ЛЗХЛ также возрастает на фоне гормональной комбинации, соответствующей III триместру, что, по-видимому, в значительной степени обеспечивается Рг, обладающим самостоятельным стимулирующим эффектом.

Таким образом, комбинация ХГ и женских половых стероидных гормонов в дозах, экстраполированных с их уровня в III триместре беременности, активирует как спонтанную, так и стимулированную окислительную активность нейтрофилов в крови небеременных женщин. Кроме того, хемилюминесценция интактных нейтрофилов стимули-

С. В. Ширшев, Е. М. Куклина, И. В. Бессонова руется под действием комбинации только Е2 и Рг в концентрации, характерной для III триместра, а люминесценция активированных нейтрофилов - в присутствии одного Рг также в дозе, близкой его концентрации в III триместре. Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что латекс обладает коактивирующим действием в отношении Рг, как и Е2 - при спонтанной ЛЗХЛ нейтрофилов.

Таблица 2

Влияние репродуктивных гормонов на окислительную активность нейтрофилов человека

№ группы	Эксперименталь-ное воздействие	Интенсивность ЛЗХЛ, имп/с (М± т)
		Спонтанный вари ант 2387,91 ± 599,508	Стимулированный вари- ант 7931,82 ± 1750,529
1	Контроль
2	ХГ, 100 МЕ/мл	2257,00 ± 592,349	8014,91 ± 1433,554
3	ХГ, 10 МЕ/мл	2337,18 ± 436,472	8811,00 + 2260,720
4	Эстрадиол, 1,0 нг/мл	2205,09 ± 455,729	8223,27 ± 1584,573
5	Эстрадиол, 10 нг/мл	2256,36 ± 539,614	8531,82 + 1922,002
6	Прогестерон, 20 нг/мл	2682,09 + 499,897	8974,55 ± 2159,879
7	Прогестерон, 100 нг/мл	3047,91 ± 856,025	9354,55 ± 2140,888*
8	Эстрадиол, 1,0 нг/мл + ХГ, 100 МЕ/мл + прогестерон, 20 нг/мл	2214,64 + 366,753	8389,36 + 1722,206
9	Эстрадиол, 10 нг/мл + ХГ, 10 МЕ/мл + прогестерон, 100 нг/мл	3517,73 + 666,358*	9947,55 ± 2187,766*
10	Эстрадиол, 1,0 нг/мл + прогестерон, 20 нг/мл	2191,46 + 408,509	7788,09 ± 1140,298
11	Эстрадиол, 10 нг/мл + прогестерон, 100 нг/мл	3794,55 ± 971,142*	8148,82 ± 1284,764

Примечание: * -Р<0,05 (сопоставление с контролем).

Корреляционный анализ не выявил статистически достоверной связи между показателями фагоцитоза нейтрофилов и люминесценции как в спонтанном, так и в стимулированном варианте. Этот факт, по-видимому, является следствием того, что гормоны, исследуемые в данной работе, по-разному модулируют окислительную и фагоцитар ную активность нейтрофилов и, возможно, действуют через различные вторичные мессенджеры.

Исключительно в плане дискуссии можно предположить, что самостоятельные фагоцитозстимули-рующие эффекты высокой дозы ХГ, сопоставимой с его концентрацией в крови женщин в 1 триместре беременности, нивелируются комбинацией половых стероидных гормонов для того, чтобы плод не сталкивался с активированными нейтрофилами. В этом случае гормоны выступают как фетопротекторы. В дозах, которые сопоставимы с эндогенной концентрацией половых стероидов и ХГ в заключительном, Ш триместре беременности, комбинация гормонов, напротив, создает условия повышенной активации нейтрофильных гранулоцитов, которые выступают физиологическими эффекторами в индукции родовой деятельности (Ширшев, 1999,2002).