Влияние rhodococcus-биосурфактантов на фитотоксичность ионов свинца

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ) является одним из самых распространенных и экологически опасных для живых организмов и их сообществ. Основными источниками загрязнения ТМ являются предприятия, которые специализируются на добыче и переработке руды металлов. нефтепродуктов, а также синтезе химических веществ. Металлы, в отличие от органических соединений, нс подвергаются процессам биодеградации; они перераспределяются между компонентами природной среды, оседают в почве или грутпах. и, в конечном итоге, по трофическим цепям передаются высшим животным и человеку.

Многие виды растений способны накапливать тяжелые металлы, причем содержание ионов ТМ в органах растений может в десятки и даже согни раз превышать их содержание в окружающей среде. Способность растений накапливать ТМ реализуется на разных уровнях организации: клеточном, тканевом и органном, что связано, прежде всего, со способностью растений накапливать металлы в клеточных оболочках и вакуолях, а также с существованием барьерных тканей, ограничивающих передвижение ряда тяжелых металлов.

По способности к аккумуляции тяжелых металлов выделяют три группы растений: (1) индифферентные растения, которые не накапливают ТМ в органах; (2) растения-исключатели, которые обладают способностью поглощать ТМ корневой системой. но не передают их в побеги: (3) растения-аккумуляторы, которые в больших количествах накапливают ТМ в тканях надземных органов [Титов и др.. 2007: Иванова, Шарф. 2011], Так. например, свинец подавляет аккумуляцию и передвижение по тканям корневой системы и побегов растений жизненно необходимых ионов Fe_+, FeJ+, Са2+, Мп2". Мп3+, Мп^+ и 2щ+, нарушая процессы их связывания с металлохелатирующими соединениями [Линдиман и др.. 2010], Свинец, в отличие от некоторых других металлов при незначительных концентрациях практически не проникает в листья [Яковншина, 2014], вызывая быстрое закрывание устьиц. Таким образом, свинец снижает транспирацию, ограничивает поступление СО; в листья и, следовательно, уменьшает интенсивность фотосинтеза, при этом барьером для ионов РЬ2" выступают эпидерма и кутикула. В то же время в условиях сильного загрязнения через листовые пластинки в ткани растения может попадать до

(С Литвиненко Л. В., Тищенко А. Т, 2017

50% свинца. содержащегося в атмосферном воздухе [Пугаев. 2013].

Существующие способы очистки почвы от ТМ базируются в основном на использовании физикохимических приемов, которые нс обеспечивают полноты удаления ионов ТМ. Более цивилизованные методы предполагают использование биологических способов очистки, таких как биовыщелачивание с помощью сурфактантов биогенного происхождения [Костина, Куюкина. Ившина. 2009], а также методов фиторемедиации [Андреева. Байбеков. Злобина. 2009]. Однако каждый из данных методов по отдельности малоэффективен при очистке почвы. Так, например, методы фиторемедиации при высоком уровне загрязнения почвы ТМ (уровень загрязнения кратностью > 100 ПДК) не используются в связи с гибелью растений [Коротченко, Львова. 2015], тогда как использование исключительно биосурфактантов также неэффективно из-за невозможности выведения десорбированных мобилизованных форм тяжелых металлов из почвы [Mulligan, Wang, 2006].

Б настоящее время в Индии и Китае активно разрабатываются комбинированные и экологически безопасные технологии очистки почвы от ТМ. основанные на использовании методов фиторемедиации и биосурфакгантов.

Цель работы - оценка влияния различных концентраций ионов свинца на прорастание семян вики полевой, горчицы белой и овса посевного в присутствии Rhodoccoctt 5-биосурфакгантов.

Материалы и методы

В сравнительных исследованиях изучали влияние йА^^ососс^л-биосурфактантов (в концентрациях 2.0; 4.0 и 8.0 г/л воды) на фитотоксичность нитрата свинца (Pb(NO₃)₂) в отношении всхожести семян растений: овса посевного (Лу^^ saliva L ), горчицы белой (Sinapis alba L) и вики полевой tyicia saliva L.). Уровень фитотоксичности определяли в соответствии СО стандартными Методическими рекомендациями МР 2.1.7.2297-07 «Обоснование класса опасности отходов производства и потребления по фитотоксичности (Фитотсст)» (МР 2. L7.2297-07, 2007). Условия проращивания: подсветка белыми люминесцентными лампами, спектр которых максимально приближен к дневному' свету: температура 23-25°С: pH = 6.3-6.5. Как видно из табл. 1, нитрат свинца добавляли из расчета кратности уровня предельно-допустимой концентрации (ПДК) ионов РЬ ⁺ с учетом фона по Кларк (ГН 2.1.7.2041-06. 2006). В качестве контроля использовали дистиллированную воду.

В работе использовали штамм актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, хранящийся в Региональной профилированной коллекции алкано-трофных микроорганизмов (ИЭГМ, No. 768 во Всемирной федерации коллекций культур;

реестровый номер УНУ гГ. ni/usu/73559). Бактериальную культуру выращивали в среде RS (Rhodococcus Surfactant) на орбитальном шейкере в течение 7 сут. (160 об/мин, 28°С). Состав среды RS (г/л): Na2HPO4 - 2.0; КН2РО4 - 2.0: KNO3 - L0; (NH.)2SO4 - 2.0; NaCl -1.0; MgSO4x7H2O - 0.2; СаСЬх2Н2О - 0.02; РсС13х7Н2О - 0.01. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали н-додекан (С]2К либо н-гексадекан (С1б) в концентрации 3 об. %. В качестве источника витаминов и фактора роста добавляли раствор микроэлементов по Пфеннигу — 1.0 мл/л и 10%-ный дрожжевой экстракт - 1.0 мл/л [Ivshina et al., 1998]. Неочищенные Я/ю£/<эсоссм5-биосурфактантные комплексы гликолипидной природы, продуцируемые родококками, получали методом [Kuyukina et al., 2001]. В тексте статьи для условного обозначения Rhodococc ^.у-биосурфактантов, продуцируем ых родококками в жидкой минеральной среде с и-додеканом, нами использован термин R Ао^срссш-биосурфактанты С ] 2; для Rhot /ососсг/.у-биосурфактантов, продуцируем ых родококками в среде с н-гексадеканом, -/?/ю^£г)ссг/.у-бносурфактанты С16.

Таблица 1

Соотношение ПДК с концентрациями ионов свинца

Уровень ПДК	Концентрация (мг/кг почвы) Pbi+ с учетом фона по Кларк
1 ПДК	32.0
10 ПДК	320.0
50 ПДК	1600.0
100 ПДК	8000.0
200 ПДК	16000.0

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами с вычислением среднего арифметического, стандартной ошибки, среднеквадратичного отклонения и доверительного интервала с помощью пакета компьютерных программ Microsoft Excel 2007 (Microsoft Inc., 2007). Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности.

Результаты и их обсуждение

Исследовано влияние спектра концентраций нитрата свинца на устойчивость и прорастание семян растений-фитоаккумуляторов в присутствии водных растворов АЛо^/огосс^у-бносурфактантов, продуцируемых при выращивании родококков в среде с я-додеканом и н -гексадеканом. В результате проведенных исследований установлено, что по степени устойчивости семян к ионам РЬ" изученные растения можно распределить в ряд: Ягеля saliva L. > Sinapis albaL. > Vida saliva L.

Результаты по исследованию влияния ионов Pb2+ на длину побегов и корневой системы овса, горчицы и вики в присутствии Rhodococcus-бисур- фактантов С] з представлены в табл. 2. Наиболее интенсивное прорастание корневой системы и побегов выявлены у овса посевного. Семена данного растения прорастали при всех используемых в ра боте концентрациях ТМ+ и в подавляющем большинстве случаев энергия их прорастания была выше, чем у семян горчицы и вики.

Таблица 2

Влияние свинца на всхожесть побегов и корневой системы (мм) овса, горчицы и вики в присутствии Яй^ссш5-биосур фактантов Сц

Варианты экс-перименга	Овёс посевной		1 орчица белая		Вика полевая
	Длина побега	Длина корня	Длина побега	Длина корня	Длина побега	Длина корня
Контроль	49Л83	40.815.2	25.219.9	22.514.8	27.316.0	19319.8
РЬ2+ 1 ПДК	443124 5	21.21103	20.715.0	14.616.8	23.214.6	—
РЬ2^ 10 ПДК	29,418,0	20.919.9	19.716.3	9.213.9	11.И3.9	-
РЬ2^ 50 ПДК	28,019,1	10.213.2	13.718.5		11.414.6
РЬ2^ 100 ПДК	14314,4	5.712.7	—	—	11313.8	—
РЬ2+ 200 ПДК	4,312,3	—	—	—	—	—
Б/нт 2 г/л	55.7114.4	48.4193	32.218.7	31.713.0	30.812.6	18.213.0
Б/пт 4 г/л	67415,7	53,016,1	39.716.7	37.013.8	32.5И.8	19313.4
Б/нт 8 г/л	45.115.2	35.113.2	24.615.0	26.218.0	27.012.0	12.313.4
1 ПДК / 2 г/л	56.5177	46.513.3	29.513.9	28315 8	29.016.2	83И.4
1 ИДК/4 г/л	64.816.6	51.817.8	37.112.5	32.815.7	31.312.4	9312.1
1 ПДК / 8 г/л	44.614.1	41.813.5	27.716.1	23.113.0	26.217.5	6.110.4
10 ПДК/2 г/л	40.9179	23.914.2	20.914.9	14.И9.1	20.714.1	2.1Ю.4
10 ПДК/4 г/л	48.916.6	24.312.6	22.016.8	16.712.1	20.013.6	8.110.6
10 ПДК/8 г/л	53.819.0	25.U4.2	19.715.0	14.313.4	19.014.2	—
50 ПДК/2 г/л	38.313.6	18.214.6	20.615.5	13.5178	19.011.6	-
50 ПДК/4 г/л	46.014.1	21.713.7	20.013.1	13312.1	22.011.4	3.110.6
50 ПДК / 8 г/л	33.412.2	15.012.8	12.217.0	3.5Ю.1	20312.7	—
100 ПДК/2 г/л	24.715.7	7.9140			16.314.3	—
1(10 ПДК/4 г/л	28.016.6	9.214.2	8.211.4	—	18.011.0	—
100 ПДК/8 г/л	31.615.0	6.512.1	—	—	14.013.7	—
200 ПДК / 2 г/л	29.213.4	8.814.8	—	—	12.814.2	—
200 ПДК/ 4 г/л	21.214.4	73133	—	—	15.613.8	—
200 ПДК / 8 г/л	25.713.3	7314.2		—	13.512.8	—

Примените, В разделе «Варианты эксперимента)) представлены используемые в работе растворы в виде концентрации ионов свинца / jR/w/(Xz>ccw^^             (ПДК / г/л).

Следует отметить полное ингибирование прорастания корневой системы у вики полевой в присутствии ионов свинца. Данная закономерность наблюдалось при всех используемых в работе концентрациях ТМ. Прорастание корневой системы семян вики полевой выявлено только в серии контрольных экспериментов и в присутствии препарата /5/гос7сосс1?5-бисурфактантов С12 в концентрации 2.0 и 4.0 г/л. Подавление прорастания семян горчицы отмечено нами при использовании нитрата свинца в концентрациях 100 и 200 ПДК.

Аналогичная тенденция наблюдалась нами при проведении экспериментов по изучению влияния ионов РЬ²^ на длину побегов и корневой системы овса, горчицы и вики в присутствии препарата /ЭДо^соссы^-бисурфакгантов С16. В табл. 3 приведены результаты измерений длины побегов и корневой системы растений овса, горчицы и вики, при прорастании их семян в водных растворах соли ТМ и препарата /^Ло^Лэ^эсс/^-бисуффактантов, полученного при культивировании родококков на н- гексадекане.

Таблица 3

Влияние с винца на всхожесть побегов и корневой системы (мм) овса, горчицы и вики в присутствии Я/г/^с^ссил-биосурфактантов Ci6

Варианты эксперимента	Овёс посевной		Горчица белая		Вика полевая
	Длина побега	Длина корня	Длина побега	Длина корня	Длина побега	Длина корня
Б/нт 2 г/л	39.5126.0	41.81213	3031114	33.6126.3	29.212.8
Б/нт 4 г/л	51.9И93	3531183	27.918.7	33,8120.1	31.811.7	-
Б/нт 8 г/л	23.517.0	23.9113.6	20317.4	40.2129.7	30.811.8	—
1 ПДК / 2 г/л	51.2126.2	52.7120.3	24.0И0.6	20,41171	34.3И.5	-
1 ПДК/4 г/л	47.3117.7	51.4116.2	22314.6	28.0110.9	29.812.5
1 ПДК / 8 г/л	34.6118.7	45.5121.8	20.416.2	16.0111.0	27.4И.6	—
10 ПДК/2 г/л	496126.8	23.9112.6	23.018.0	12014.2	27314.1	-

Окончание табл. 3

Варианты экспериме!гга	Овёс посевной		Горчила белая		Вика полевая
	Длина побега	Длина корня	Длина побега	Длина корня	Длина побега	Длина корня
10 ПДК / 4 г/л	65.7±25.4	41,6±15.6	21.3±3.7	15.1 ±6.4	29.6±3.4	—
10 ПДК / 8 г/л	54.3±28.6	23.3±6.8	19.5±6.2	9.3±5.5	26.2±2.1	—
50 ПДК / 2 г/л	43.9±19.2	15.6±5.8	18.7±3.5	4.2-2.1	18.6^2.5	—
50 ПДК / 4 г/л	41.5±20.9	16.3±4.0	16.0±2.4	5.1 : 1.4	23.3±4.2	—
50 ПДК / 8 г/л	53.8^21.0	13.2±5.2	14.9±2.6	—	21.7±3.3	—
100 ПДК / 2 г/л	31.2±14.2	8.2±3.0	—	—	19.0±2.4	—
100 ПДК / 4 г/л	34.7±15.8	6.7±1.8	—	—	15.2±1.6	—
100 ПДК/8 г/л	26.6±8.1	7.Н3.6	—	—	18.4±1.4	—
200 ПДК / 2 г/л	12.2±7.6	—	—	—	11.2±0.6	—
200 ПДК/ 4 г/л	14.8±8.8	8.3±4.7	—	—	8.6±1.2	—
200 ПДК / 8 г/л	14.9±8.5	3.0±0.7	—	—	—	—

Примечание. В разделе «Варианты эксперимента» представлены используемые в работе растворы в виде концентрации ионов свинца / /^(х/ососси^-биосурфакгангов (ПДК / г/л).

Как видно на рис. 1. наиболее высокая степень всхожести (100%) семян овса выявлена в присутствии ионов свинца в концентрации 1 ПДК, самый низкий уровень всхожести семян (64%) отмечен нами в условиях обработки овса посевного раствором ТМ в концентрации 100 ПДК. Можно отметить. что прорастание семян овса в условиях содержания ТМ в концентрациях 10 и 50 ПДК отличаются друг от друга на 2%.

■ Кол-во проросших семян

ИНН

Вода       1        10       50       100      200

Концентрация свинца (ПДК)

Рис. 1. Всхожесть семян Avena saliva в присутствии ионов свинца (ПДК. мг/кг почвы)

Как видно на рис. 2, всхожесть семян овса в растворах с нитратом свинца выше после обработки их препаратом ЛАо^огогги^-биосурфактантов, продуцированных родококками на //-гексадекане, по сравнению с обработкой Rhodococxus-биосур-фактантами С12. При добавлении Rhodococcus-биосурфактантов Ci6 в концентрации 2.0 г/л всхожесть семян овса выше на 26%. тогда как при концентрации препарата биосурфактантов Cie 4.0 г/л семена овса прорастают в 6.5 раз более интенсивно по сравнению с вариантом эксперимента при обработке семян Я/ю/й^^сда-биосурфактантами С12. Всхожесть семян овса в среднем на 24% выше в присутствии /^Ло^соссмх-биосурфактантов (8.0 г/л), продуцируемых родококками на н-гекса-декане. по сравнению с его всхожестью в присутствии биосурфактантов, продуцируемых на //-додекане.

Суммарное количество проросших семян овса в присутствии ионов ТМ и Rhodococcus -биосурфактантов. продуцированных родококками на //-додекане, выше в 1.2—2.7 раз, по сравнению с вариантами эксперимента с использованием растворов свинца и биосурфактантов, продуцированных в среде с н-гексадеканом (рис. 2).

Рис. 2. Всхожесть семян Avena saliva в присутствии ионов свинщ и биосурфактантов (ПДК, мг/кг почвы / г/л).

*Статистически достоверно (р < 0,05) от /^/tidbcoccz/5-6nocyp(])a^ С12; С12 -№х/бхчл7с//5-биосурфактаэт^ продуцируемые на //-додекане; Сю -/^za/ococcz/5-биооурфактангы, продуцируемые на //-гексадекане

Как видно на рис. 3, наиболее высокий уровень всхожести (60%) семян горчицы выявлен нами при прорастании их в присутствии ионов свинца в концентрации 1 ПДК. Всхожесть семян горчицы в присутствии ионов свинца в концентрациях 10 и 50 ПДК отличается между собой на 2%. При более высоких концентрациях свинца прорастание семян горчицы нами не выявлено.

Рис. 3. Всхожесть семян Sinapis alba в присутствии ионов свинца (ПДК, мг/кг почвы)

Как видно на рис. 4, количество проросших семян при обработке их Rhodococcus-биосурфак- тантом Cie выше на 6%. чем Rhodococcus-бт- сурфактантом С12 при концентрации препаратов 2.0 г/л. Однако при обработке семян горчицы биосурфактантами, продуцированными на //-додекане.

всхожесть семян в 1.3-1.5 раз выше, чем на н- гексадекане при использовании растворов в концентрации 4.0 и 8.0 г/л. Как видно из рис. 4. всхожесть семян горчицы в 1.5-7.2 раз лучше при обработке их /?//о^ос(?ссг/5-биосурфактантами С16, по сравнению с прорастанием семян после обработки их /tAodbeocci/5-биосурфактантами С] 2. При концентрации свинца выше 100 ПДК всхожесть семян горчицы нами нс выявлена. Всхожесть семян вики полевой в присутствии нитрата свинца в концентрации 50 ПДК в 1.6 раз более интенсивна, по сравнению с таковой при концентрации ТМ 10 ПДК и в 2.6 раз выше по сравнению с прорастанием семян вики в присутствии ТМ в концентрации 200 ПДК (рис 5).

Как видно на рис. 6. всхожесть семян вики полевой при обработке их препаратом Rhodococcus- биосурфактантов С12 в 1.6-3.0 раза выше по сравнению с всхожестью семян после обработки их растворами /?/?(><7ососсм5-биосурфактантов Cie. Исключение из данной тенденции составили варианты эксперимента с концентрацией нитрата свинца 10 ПДК. Следует отметить, что в варианте эксперимента с обработкой семян препаратами био-сурфактантов в концентрации 4.0 г/л в присутствии ТМ в концентрации 1 ПДК прорастания семян вики нами не выявлено.

Рис. 4. Всхожесть семян Sinapis alba в присутствии ионов свинца и биосурфактантов (ПДК, мг/кг почвы / г/л).

продуцируемые на //-додекане; Ci6-7^<%fcxv>ceHS-6nocy^         продуцируемые на н-гексадекане

Рис. 5. Всхожесть семян Vieta saliva в присутствии ионов свинца (ПДК. мг/кг почвы)

Концентрация свинца (ПДК) / биосурфакганта (г/л)

Рис. 6. Всхожесть семян Vicia saliva в присутствии ионов свинца и биосурфактантов (ПДК, мг/кг почвы / г/л).

♦Статистически достоверно (р < 0,05) аг /^к)^<х^ем$-биосурфак^ Ci£ С12 -/^?о^бХ'<%с7/5-биосурфак1'аты, продуцируемые на //-додекане; С|б-/Укх/(Эгосп/$-био^^         продуцируемые на //-гексадекане

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований нами установлено, что наиболее устойчивым растением к действию ионов РЬ²⁴ является овес посевной, менее устойчивы семена вики полевой. Уровень прорастания семян овса колебался от 10 до 92% в зависимости от концентрации ионов свинца. Следует отметить, что побеги и корневая система семян овса при добавлении Rhodoccocus- биосурфактантов с л-гексадеканом. были длиннее на 6.9 и 5.3 см. соответственно, по сравнению с таковым при изучении фитотоксичности ионов РЬ² в присутствии ЛЛог/оссосд/л-биосурфактантов с н- додеканом. Семена горчицы и вики при концентрации ионов РЬ² 50 ПДК и выше не прорастали.

Ионы РЬ‘ во всех вариантах эксперимента ингибировали прорастание корневой системы у вики полевой, тогда как количество проросших побегов не превышало 12%.

Исследования поддержаны Российским Научным Фондом (14-14-00643) и грантом Комплексной программы УрО РАН (15-12-4-10).