Влияние сахарного диабета на уровень факторов роста в карциноме Герена у крыс обоего пола

Введение. Сахарный диабет (СД) представляет собой фактор риска развития рака, в частности рака печени, гепатобилиарной системы, поджелудочной железы, груди, яичников, эндометрия и желудочно-кишечного тракта. Есть также данные о том, что СД связан с повышенной смертностью от рака [1]. Супрафизиологические концентрации инсулина и глюкозы, воздействию которых подвергаются ткани тела, представляют собой мощный фактор роста и источник энергии. Они необходимы для неопластической трансформации и прогрессирования рака [2]. СД и рак представляют собой общие проблемы для здоровья и очень часто имеют место у одного человека. В целом от 8 до 18 % людей, страда ющих раком, также страдают диабетом [2]. Хотя механизмы, которые могут связывать СД с раком, еще полностью не изучены. Несколько экспериментальных наблюдений показали, что множественные факторы риска, включая пути пролиферации и апоптоза, могут быть общими для СД и рака. Так, основными факторами риска признаны гипергликемия, гиперинсули-немия, повышенная биоактивность ряда факторов роста (в частности, инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1)), окислительный стресс, нарушение регуляции половых гормонов и хроническое воспаление [1, 3].

Злокачественным клеткам для выживания и размножения требуются кислород и питательные вещества, поэтому они должны нахо- диться в непосредственной близости от кровеносных сосудов для доступа к системе кровообращения [4]. Исследования показывают, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является положительным регулятором ангиогенеза в физиологических и патологических состояниях, стимулирующим деградацию внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток и регулирующим проницаемость сосудов [5]. Патологический ангиогенез также коррелирует с диабетической микроваскулопатией во многих органах, играя критическую роль в диабетической ретинопатии, нефропатии, невропатии, нарушении образования коллатеральных сосудов и других системных состояниях [6–8]. Несколько факторов, связанных с диабетом, приводят к ангиогенной стимуляции, в которой в первую очередь задействован сигнальный путь VEGF. В частности, было продемонстрировано, что диабет вызывает дефектную передачу сигналов VEGF, приводящую к нарушению активации рецепторов тирозинкиназы Flk-1, участвующих в различных процессах ангиогенеза и передаче сигналов VEGF. Эта пониженная активность приводит к увеличению уровней VEGF в сыворотке, вызывая патологический ангиогенез [9]. Существует несколько факторов, участвующих в аномальном ангиогенезе при диабете: хронический воспалительный статус, усиливающий транскрипцию VEGF, и индуцируемый гипоксией фактор-1α (HIF-1α); состояние гипоксии, которое заставляет клетки активировать VEGF и другие проангиогенные агенты; наличие окислительного стресса с секрецией провоспали-тельных цитокинов, таких как TNFα, трансформирующих факторов роста альфа (TGFα) и бета (TGFβ) и интерлейкины 6 и 8; гипергликемия и конечные продукты гликирования, которые вносят вклад в нарушение ангиогенного потенциала in vitro, и другие избыточные тканевые факторы [5].

Цель исследования. Изучение уровня некоторых факторов роста и их рецепторов в ткани карциномы Герена, растущей на фоне сахарного диабета, и ее перифокальной зоне у крыс обоего пола.

Материалы и методы. В исследование включены самцы и самки белых нелинейных крыс весом 180–220 г, полученные из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область), содержавшиеся при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах (Директива 86/609/ЕЕС), Международными рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных и приказом Минздрава России от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Протокол экспериментального исследования одобрен комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 01.09.2020, протокол этического комитета № 21/99.

Животные каждого пола были разделены на 2 группы по 18 особей: контрольная группа – рост перевивной карциномы Герена, основная группа – рост перевивной карциномы Герена на фоне аллоксанового диабета. Для воспроизведения сахарного диабета животным однократно внутрибрюшинно вводили аллоксан в дозировке 150 мг/кг веса. Далее в течение недели у них ежедневно измеряли содержание глюкозы в крови. Высокое содержание глюкозы в крови (в пределах 15–30 ммоль/л) свидетельствовало о развитии сахарного диабета. На момент перевивки карциномы Герена у животных основной группы средние показатели глюкозы в крови составили 25,4±1,2 ммоль/л, тогда как в контрольной группе – 5,2±0,3 ммоль/л. Крысам контрольной и основной групп спустя 1 нед. стойкой гипергликемии подкожно вводили по 0,5 мл взвеси клеток опухоли Герена в физиологическом растворе в разведении 1:5. Забой животных проводили через 10 дней роста опухоли. В опухоли и перифокальной зоне у животных методом ИФА определяли содержание VEGF-A, VEGF-C и их рецепторов sVEGF-R1 и sVEGF-R3, EGF и sEGF-R, TGFβ1 и sTGFβ1-R2, TNFα и sTNFα-R1, FGF21 (Casabio, Китай).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statisti-ca 10.0. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Соответствие распределения нормальному оценивали с помощью критерия Шапиро – Уилка. Значимость различий между независимыми выборками определяли с помощью критерия Манна – Уитни и t-критерия Стьюдента. Значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты. В ходе эксперимента было установлено, что через 10 дней роста карциномы Герена под влиянием сахарного диабета объем опухоли у самцов был больше в 1,4 раза по сравнению с показателем в контрольной группе (17,5 против 12,3 см³, p<0,05), тогда как у самок объем первичного узла, напротив, оказался в 1,5 раза меньше (13,5 против 20,4 см³, p<0,05). У самок основной группы через 15 дней выявлена генерализация опухолевого процесса с метастатическим поражением яичников, почек, париетальной и висцеральной брюшины, но с меньшим в 1,3 раза объемом первичного узла (39,35±3,8 против 50,4±5,2 см³, р<0,05), у самок в группе контроля метастазы не обнаружены. У самцов через 15 дней опухолевого роста объем первичного узла в основной группе оказался в 2,4 раза больше, чем в контрольной группе (95,35±9,5 против 40,2±4,2 см³).

В результате средняя продолжительность жизни животных обоего пола в основной группе оказалась меньше, чем в контрольной: у самок в 1,7 раза (15,8 против 26,5 сут), у самцов в 1,6 раза (17,2 против 27,3 сут).

У самок основной группы в образцах опухоли был выше уровень VEGF-C в 1,4 раза (p<0,05), EGF в 1,7 раза (p<0,05), TNFα в 14 раз, FGF21 в 1,7 раза (p<0,05), но ниже содержание EGF-R в 1,5 раза (p<0,05), TGFβ1 в 2,1 раза и TNFα-R1 в 1,7 раза (p<0,05) по сравнению с показателями в контрольной группе (табл. 1). Содержание VEGF-A, sVEGF-R1, sVEGF-R3, TGFβ1-R2 не имело достоверных отличий.

Учитывая роль растворимых рецепторов факторов роста как «ловушек» активных форм факторов роста, нами были рассчитаны соотношения лиганда и растворимого рецептора, которые демонстрировали содержание свободного, активного фактора роста. У самок основной группы в образцах опухоли по сравнению с показателями в контрольной группе было больше соотношение VEGF-C/VEGF-R3 в 1,3 раза (p<0,05), EGF/EGF-R в 2,6 раза, TNFα/TNFα-R1 в 24,5 раза и, напротив, меньше TGFβ1/TGFβ1-R2 в 2,3 раза, при этом VEGF-A/VEGF-R1 не имело достоверных отличий.

В перифокальной зоне у самок основной группы был ниже уровень VEGF-A и VEGF-R1 в 1,5 раза (p<0,05), VEGF-C в 11,7 раза, EGF в 1,9 (p<0,05) и FGF21 в 2,2 раза, но выше содержание TNFα и TNFα-R1 в 1,3 и 1,4 раза (p<0,05) соответственно по сравнению с аналогичными показателями в группе контроля. В перифокальной зоне основной группы не выявлено значимых отличий в содержании VEGF-R3, EGF-R, TGFβ1, TGFβ-R2 и значениях VEGF-A/VEGF-R1, TGFβ1/TGFβ-R2 и TNFα/TNFα-R1.

Соотношение EGF/EGF-R было ниже в 2,2 раза, а соотношение VEGF-C/VEGF-R3 – в 11,5 раза по сравнению с показателями контрольной группы.

Далее, учитывая половые различия в характере роста опухоли на фоне сахарного диабета, было целесообразно провести аналогичные исследования факторов роста в опухоли и перифокальной зоне у самцов (табл. 2).

У самцов основной группы в образцах опухоли было ниже содержание VEGF-R1 в 1,4 раза (p<0,05), VEGF-C в 1,9 раза (p<0,05), TGFβ1 в 1,7 раза (p<0,05), EGF в 1,9 раза (p<0,05), EGF-R в 1,8 раза (p<0,05), VEGF-C/VEGF-R3 в 1,9 раза и TGFβ1/TGFβ-R2 в 1,6 раза, но выше концентрации TNFα в 1,4 раза (p<0,05), TNFα/TNFα-R1 в 1,7 раза (p<0,05) и VEGF-A/VEGF-R1 в 1,6 раза (p<0,05) по сравнению с показателями в контрольной группе (табл. 2). При этом не установлено значимых отличий показателей VEGF-A, VEGF-R3, EGF/EGF-R, TGFβ1-R2, TNFα-R1 и FGF21.

В перифокальной зоне у самцов основной группы было ниже содержание VEGF-A в 2,9 раза, VEGF-R1 в 1,5 раза (p<0,05), VEGF-A/VEGF-R1 в 1,9 раза, VEGF-C в 52,2 раза, VEGF-C/VEGF-R3 в 47,5 раза, EGF в 2,9 раза, EGF/EGF-R в 4 раза, TGFβ1 и TGFβ-R2 в 4,7 и 1,6 раза (p<0,05), TGFβ1/TGFβ-R2 в 3 раза, TNFα и TNFα-R1 в 5,1 и 1,9 раза соответственно, TNFα/TNFα-R1

в 2,6 раза, но выше концентрации EGF-R в 1,4 раза (p<0,05) и FGF-21 в 3,3 раза по сравнению с показателями группы контроля.

Не найдено значимых отличий в уровне VEGF-R3 в перифокальной зоне под влиянием сахарного диабета.

Таблица 1

Table 1

Содержание факторов роста в ткани опухоли Герена и ее перифокальной зоне у самок крыс

Levels of growth factors in tissues of Guerin carcinoma and its perifocal zone in female rats

Показатель Parameter	Контрольная группа Control group		Основная группа Main group
	опухоль carcinoma	перифокальная зона perifocal zone	опухоль carcinoma	перифокальная зона perifocal zone
VEGF-A, пг/гтк VEGF-A pg/ml	11194,4±975	362,7±31,1	11802,7±837	236,4±21,41
sVEGF-R1, нг/гтк sVEGF-R1 ng/ml	13,5±1,2	24,4±2,2	16,4±1,4	15,9±1,471
VEGF-A/VEGF-R1	829,2±79,5	14,9±1,3	678,3±57,3	14,9±1,4
VEGF-C, нг/гтк VEGF-C, ng/ml	37,6±3,1	69,3±6,5	51,8±4,71	5,9±0,491
sVEGF-R3, нг/гтк sVEGF-R3, ng/ml	10,0±0,9	10,1±1,2	10,5±1,1	9,9±0,87
VEGF-С/VEGF-R3	3,76±0,41	6,9±0,8	4,93±0,391	0,60±0,041
EGF, пг/гтк EGF, pg/ml	3,3±0,30	5,6±0,45	5,6±0,521	2,9±0,261
sEGF-R, нг/гтк sEGF-R, ng/ml	18,9±1,7	2,7±0,18	12,6±1,11	3,1±0,29
EGF/sEGF-R	0,17±0,01	2,1±0,2	0,44±0,041	0,94±0,071
TGFβ1, пг/гтк TGFβ1, pg/ml	723,8±6,9	431,1±41,1	339,2±31,71	385,9±36,7
sTGFβ-R2, пг/гтк sTGFβ-R2, pg/ml	176,7±16,4	188,5±17,2	185,8±17,9	169,8±14,5
TGFβ1/sTGFβ-R2	4,1±0,36	2,28±0,21	1,8±0,171	2,27±0,21
TNFα, пг/гтк TNFα, pg/ml	14,7±1,2	58,2±4,3	208,0±19,51	74,0±6,91
sTNFα-R1, пг/гтк sTNFα-R1, pg/ml	12,13±0,98	11,2±0,9	7,0±0,631	15,9±1,41
TNFα/sTNFα-R1	1,21±0,11	5,2±0,48	29,7±1,71	4,65±0,41
FGF21, пг/гтк FGF21, pg/ml	76,4±6,7	69,77±5,6	130,1±11,51	31,3±2,71

Примечание. ¹ – статистически значимые отличия по сравнению c показателями в группе контроля.

Note. ¹ – the differences are significant compared with the control group.

Таблица 2

Table 2

Содержание факторов роста в ткани опухоли Герена и ее перифокальной зоне при различных вариантах роста у самцов крыс

Levels of growth factors in tissues of Guerin carcinoma and its perifocal zone in male rats with different tumor growth profiles

Показатель Parameter	Контрольная группа Control group		Основная группа Main group
	опухоль carcinoma	перифокальная зона perifocal zone	опухоль carcinoma	перифокальная зона perifocal zone
VEGF-A, пг/гтк VEGF-A, pg/ml	10370,2±987,6	1538,6±145,2	11931,0±1078	537,4±51,41
sVEGF-R1, нг/гтк sVEGF-R1, ng/ml	29,0±2,5	6,5±0,61	20,8±1,91	4,4±0,411
VEGF-A/VEGF-R1	357,6±31,3	236,7±20,4	573,61±48,91	122,14±10,21
VEGF-C, нг/гтк VEGF-C, ng/ml	60,5±5,7	130,6±11,8	32,1±2,71	2,5±0,191
sVEGF-R3, нг/гтк sVEGF-R3, ng/ml	10,3±1,0	11,4±1,1	10,6±1,2	10,5±1,1
VEGF-С/VEGF-R3	5,87±0,55	11,4±1,1	3,03±0,291	0,24±0,021
EGF, пг/гтк EGF, pg/ml	6,9±0,67	4,3±0,42	3,7±0,311	1,5±0,141
sEGF-R, нг/гтк sEGF-R, ng/ml	33,0±3,1	15,6±1,4	18,7±1,61	21,6 ±1,91
EGF/sEGF-R	0,21±0,019	0,28±0,025	0,20±0,01	0,07±0,0051
TGFβ1, пг/гтк TGFβ1, ng/ml	1763,7±165,2	1557,5±148,9	1045,4±99,61	329,2±31,11
sTGFβ-R2, пг/гтк sTGFβ-R2, pg/ml	236,5±21,5	347,8±33,7	228,7±21,7	223,5±20,71
TGFβ1/sTGFβ-R2	7,46±0,71	4,48±0,41	4,6±0,421	1,47±0,121
TNFα, пг/гтк TNFα, pg/ml	155,1±14,8	296,5±28,9	210,1±19,41	58,0±4,81
sTNFα-R1, пг/гтк sTNFα-R1, pg/ml	11,8±0,99	10,8±1,0	9,6±0,87	5,6±0,541
TNFα/sTNFα-R1	13,14±1,2	27,45±2,5	21,9±1,91	10,36±0,981
FGF21, пг/гтк FGF21, pg/ml	39,3±3,8	20,7±1,9	38,2±3,6	69,1±5,91

Примечание. ¹ – статистически значимые отличия по сравнению c показателями в группе контроля.

Note. ¹ – the differences are significant compared with the control group.

Таким образом, в зависимости от характера роста карциномы Герена под влиянием сахарного диабета у самцов и самок крыс выявлены особенности изменения факторов роста в опухоли и перифокальной зоне.

Обсуждение. В эксперименте у животных обоего пола с карциномой Герена, растущей на фоне сахарного диабета, снижалась продолжительность жизни, однако выявлены половые особенности роста злокачественной опухоли. У самок основной группы на фоне СД размеры первичного опухолевого узла уменьшались, но обнаруживалось метастатическое поражение внутренних органов (яичников, почек и брюшины), тогда как у самцов увеличивались объемы первичного узла без выявленных метастазов.

Известно, что рост злокачественной опухоли связан с неоангиогенезом, который дает неоплазме возможность дальнейшего развития. В экспериментальных исследованиях меланомы выявлено повышение в опухоли уровня VEGF-A и VEGF-C [10]. В отношении сахарного диабета ситуация двойственная. Окислительный стресс, вызываемый сахарным диабетом, индуцирует ишемический ангиогенез и повышение уровня VEGF. Увеличение площади ишемии повышает выработку VEGF до более критического уровня, что приводит к развитию неоваскуляризации [6]. Установлено, что при диабетической ретинопатии повышается уровень VEGF с развитием макулярного отека, при этом использование анти-VEGF-терапии уменьшает выраженность отека макулы и повышает остроту зрения [7]. С другой стороны, имеются данные о дефиците ангиогенеза при диабетических ранах, который в первую очередь связан со снижением экспрессии проангиогенных факторов, таких как VEGF [8]. Важно также отметить сложную взаимосвязь между уровнями VEGF и прогрессированием сахарного диабета, особенно учитывая тот факт, что уровни VEGF в плазме не отражают содержание VEGF в тканях внутренних органов [11].

У самцов крыс основной группы на фоне роста первичного узла увеличилось соотношение VEGF-A/VEGF-R1, но снизилось VEGF-C/VEGF-R3 без изменения содержания FGF21 и соотношения EGF/EGF-R. У самок основной группы в образцах карциномы при уменьшении объема первичного узла на фоне активации процессов метастазирования возросла концентрация FGF21 и увеличились соотношения VEGF-C/VEGF-R3 и EGF/EGF-R, без изменения осталось VEGF-A/VEGF-R1. Можно предположить, что увеличение содержания свободной формы VEGF-A у самцов стимулирует увеличение объемов первичного опухолевого узла, тогда как повышение концентрации VEGF-C, EGF и FGF21 у самок связано с повышенной метастатической активностью карциномы Герена.

Исследования показывают, что, хотя путь VEGF признан ключевым медиатором ангиогенеза для поддержки туморогенеза, важными индукторами его активации являются некоторые факторы роста, в т.ч. EGF и FGF. Известно, что EGF способствует пролиферации клеток [12]. В то же время предполагается участие гормоноподобного FGF21 в метаболизме глюкозы независимо от инсулина, влияние его на инсулинорезистентность в периферических тканях пациентов с сахарным диабетом, а также повышение в крови у беременных женщин с гистиоцитозом [13].

В результате исследования установлено, что у животных основной группы обоего пола в опухоли уровень свободного TGFβ1 был ниже, а содержание свободного TNFα, рассчитываемое по соотношению лиганда и растворимого рецептора, выше по сравнению с опухолевыми образцами в группах контроля. Мы предполагаем, что данные изменения связаны с влиянием сахарного диабета на рост опухоли. В последние годы принято считать, что TNFα является фактором, связанным с механизмами развития диабетической инсулино-резистентности [14]. Сообщается, что уровень TNFα в сыворотке больных диабетом значительно выше, чем у здоровых людей [15]. TGFβ – это цитокин, выполняющий множество функций внутри организма, включая апоптоз, иммунный ответ клеток, дифференцировку, пролиферацию клеток и заживление ран [16]. Недавние экспериментальные исследования показали, что TGFβ1 может играть значимую роль в развитии инсулинорезистентности и ожирения. Так, при измерении уровня TGFβ1 в сыворотке крови у детей и подростков установ- лена положительная взаимосвязь между длительностью течения СД1 и осложнениями со стороны сосудистой системы. Эффекты TGFβ1 возникают в результате связывания с рецепторами TGFβ1 типа II [15].

Интерес вызвал тот факт, что у самцов в перифокальной зоне карциномы Герена под влиянием СД содержание практически всех исследованных факторов роста оказалось низким, за исключением FGF21, уровень которого, напротив, повысился. Высокие значения FGF21 в перифокальной зоне у самцов основной группы можно связать с особенностями как гормонального фона, так и содержания глюкозы. У самок основной группы в перифокальной зоне выявлен низкий уровень VEGF-C, EGF и FGF21 по сравнению с контрольной группой, но достоверных различий в содержании VEGF-A, TGFβ1 и TNFα не установлено. Можно предположить, что выявленное у животных основной группы снижение уровня факторов роста в перифокальной зоне может быть связано с их активным транспортом в опухоль. В результате торможение роста первичного узла, но повышение агрессивности опухоли за счет активного метастазирования у самок мышей основной группы происходило на фоне преимущественной концентрации VEGF-C в образцах карциномы Герена из ее перифокальной зоны, тогда как у самок контрольной группы содержание VEGF-C преобладало в зоне, окружающей первичную опухоль. Неоваскуляризация опухоли в основном состоит из эндотелийзависимого ангиогенеза, васкулогенеза, лимфангиогенеза и эндотелий-независимой васкулогенной мимикрии и вли- яет на гематогенные и лимфогенные метастазы. Неопластические клетки из первичных очагов могут напрямую проникнуть в кровь и давать начало гематогенным отдаленным метастазам. С другой стороны, раковые клетки могут инициировать процесс их лимфогенного метастазирования, проникая в лимфатические сосуды, распространяясь в сторожевые, а затем в отдаленные лимфатические узлы с током лимфы, затем попадать в вены и в конечном итоге метастазировать в удаленный орган-мишень [17]. Кроме того, известно, что вырабатываемый VEGF не только стимулирует ангиогенез, но и увеличивает проницаемость сосудов [18]. Ось VEGF-C/VEGF-R3 важна для роста лимфатического синуса и увеличения лимфотока, что коррелирует с метастазированием солидных опухолей и диссеми-нацией злокачественных клеток [19]. Также имеются сведения о том, что VEGF-C, как лиганд VEGF-R3, является ведущим медиатором расширения кровеносных сосудов. Исследования показали, что молекулы, нацеленные на сигнальный путь VEGF-C/VEGFR-3, могут ограничивать рост опухоли или метастазирование рака [20].

Заключение. Итак, сахарный диабет, как сопутствующее злокачественному росту заболевание, способствует повышению в образцах опухоли соотношения VEGF-A/VEGF-R1 у самцов, VEGF-С/VEGF-R3, EGF/sEGF-R и уровня FGF21 у самок, что сопровождается снижением продолжительности жизни животных обоего пола на фоне роста объемов опухоли у самцов и активации метастатических процессов у самок.