Влияние селективных сред с тяжелыми металлами на рост и развитие Fagopyrum esculentum Moench in vitro

Введение. Гречиха посевная Fagopyrum esculentum Moench – культура многоцелевого использования. Из нее получают продукты питания, лекарства, зеленое удобрение, это прекрасный медонос и богатый источник рутина, катехинов и других флавоноидов [1]. Она обладает высокой пластичностью и большим потенциалом в селекционных программах [2]. Применение биотехнологических методов в выведении новых сортов считается перспективным направлением сельскохозяйственной науки. Селекция F. esculentum с использованием тяжелых металлов (ТМ) в качестве селективных фонов in vitro может быть новым инструментом создания растений с улучшенными показателями и высоким потенциалом устойчивости к средовым абиотическим стрессорам [3].

Влияние селективных сред, содержащих повышенные дозы солей цинка (46–606 мг/л) и меди (6–230 мг/л), на рост и развитие микропобегов гречихи посевной исследовано в более ранних наших работах [4]. Однако существует мнение, что повышение жесткости селективных систем является весьма эффективным методом селекции [5], поэтому изучение токсического воздействия более высоких доз тяжелых ме- таллов на культуру гречихи посевной in vitro может быть перспективным направлением решения селекционных задач.

Цель исследования – изучить влияние токсического действия высоких доз цинка (808–1313 мг/л) на жизнеспособность пробирочных растений-регенерантов Fagopyrum esculentum Moench и получить in vitro исходный материал гречихи с использованием селективных сред с Zn²⁺.

Объекты и методы. Объектами исследования являлись одноузловые черенки (длина 1,0– 1,5 см) регенерантов гречихи посевной сорта Изумруд селекции ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, которые получали в результате деления стебля пробирочных микрорастений (2–3 нижних междоузлия), ранее прошедших отбор в селективных условиях с CuSO 4 × 5H 2 O в концентрации 161 и 184 мг/л [4]. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22– 25 °С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам.

Для создания селективных условий использовали соль цинка (ZnSO 4 х 7H 2 O). В основную питательную среду Мурасиге-Скуга [6] (далее МС), содержащую 20 г/л сахарозы и 6 г/л агара, вносили соли цинка в следующих количествах по вариантам опыта: 808, 909, 1010, 1111, 1212 и 1313 мг/л. Контрольным вариантом являлась среда МС с сахарозой и агаром и со стандартным содержанием сульфата цинка 8,6 мг/л. Число пробирок по каждому варианту – 20. Повторение – 5.

Морфологические показатели определяли на 21-е сут культивирования растений на контроле и селективных средах с цинком, а также по окончании последующих пассажей (каждый пассаж длительностью 33 сут) на питательных средах МС. Измеряли высоту каждого пробирочного растения и длину его листовых пластинок, которые выражали соответственно в см и мм, считали число междоузлий и число листьев (шт.), отмечали наличие (+) или отсутствие (-) корней. Окраску листьев определяли визуально по преобладающему цвету всех листовых пластинок растения.

Для ввода данных, обработки исходных данных и статистического анализа использовали пакет программ Microsoft Excel 2010. Программное обеспечение Statistica 6 [7] использовали для выполнения однофакторного дисперсионного анализа. Тест множественного рангового критерия Дункана (p < 0,05) применяли для измерения значимости различий. Результаты выражаются в виде средних значений ± стандартное

Результаты и их обсуждение. Исследование устойчивости пробирочных растений-регенерантов линий гречихи сорта Изумруд, полученных в результате отбора после обработки CuSO 4 × 5H 2 O, к высоким дозам цинка и их морфологический анализ проводили на 21-й день культивирования микроклонов на селективных средах (табл. 1).

Все испытуемые линии существенно отставали в развитии по сравнению с контролем, особенно по показателю высота растения, которая в среднем составила 0,38–2,01 см (в 3,5– 14,1 раза меньше, чем у растений контрольной группы), и приобретали желто-зеленую окраску. Листовые пластинки стали более мелкими, длиной 3,78–8,70 мм, а их количество снизилось на 21,6–66,6 % по сравнению с контролем. Количество междоузлий уменьшилось в 1,9–3,8 раз. Максимальное негативное воздействие на микроклоны оказали селективные условия с концентрацией от 909 до 1313 мг/л ZnSO 4 × 7H 2 O. Сильная токсическая нагрузка повлияла на кор-необразование (важнейший показатель, отражающий состояние растений в условиях стресса) – ризогенез отсутствовал на всех вариантах. По мнению многих исследователей, токсичность тяжелых металлов, приводящая к снижению роста и развития растений, обусловлена в первую очередь окислительным стрессом, индуцируемым ТМ; в итоге нарушается работа фотосинтетического аппарата и всего растительного организма в целом [8, 9].

отклонение.

Таблица 1

Влияние селективных сред с ZnSO 4 × 7H 2 O на развитие микрорастений гречихи, толерантных к повышенному содержанию меди, на 21-е сут культивирования

Вариант содержания соли цинка	Высота растения, см	Число междоузлий, шт.	Число листьев, шт.	Длина листовой пластинки, мм	Наличие корней, +/-	Окраска листьев
1	2	3	4	5	6	7
Изумруд in vitro после CuSO 4 х 5H 2 O 161 мг/л
Контроль	7,03±2,60 c	3,78±0,44 c	5,11±0,78 c	11,33±2,45 c	+	Зеленые
808 мг/л	2,01±1,32 b	2,00±0,67 b	3,80±1,23 b	7,90±1,66 b	–	Зелено-желтые
909 мг/л	1,44±0,56 b	1,38±0,52 a	3,50±1,31 а	8,13±1,36 b	–	Желто-зеленые
1010 мг/л	0,69±0,28 a	1,00±0,00 a	2,80±1,23 a	6,50±2,17 b	–	Желто-зеленые
1111 мг/л	0,43±0,23 a	1,00±0,00 a	2,86±0,69 a	6,43±1,99 b	–	Желто-зеленые
1212 мг/л	0,56 ±0,40 a	1,00±0,00 a	2,60±0,70 a	4,50±2,99 a	–	Желто-зеленые
1313 мг/л	0,51±0,37 a	1,00±0,00 a	2,89±0,93 a	3,78±2,54 a	–	Желто-зеленые

Окончание табл. 1

1	2	3	4	5	6	7
Изумруд in vitro после CuSO 4 х 5H 2 O 184 мг/л
Контроль	6,64±2,75 b	3,8±0,42 c	5,10±0,74 b	11,1±2,42 d	+	Зеленые
808 мг/л	1,18±0,81 а	1,60±0,70 b	3,00±0,67 а	8,70±2,31 c	–	Зеленые
909 мг/л	0,90±0,62 а	1,56±0,53 b	2,33±0,50 a	7,56±2,40 bс	–	Зелено-желтые
1010 мг/л	0,82±0,29 a	1,11±0,33 a	2,67±0,71 a	7,33±1,80 аbс	–	Зелено-желтые
1111 мг/л	0,47±0,39 a	1,11±0,32 a	2,60±0,52 a	5,70±1,16 ab	–	Желто-зеленые
1212 мг/л	0,56±0,27 a	1,11±0,33 a	2,44±0,73 a	6,89±2,09 аbс	–	Желто-зеленые
1313 мг/л	0,38±0,28 a	1,11±0,32 a	2,50±0,71 a	5,30±2,54 a	–	Желто-зеленые

Здесь и далее: разные строчные буквы (а, b, с, d) в одном и том же столбце по каждому опыту ука- зывают на значимые различия между вариантами при P < 0,05.

При дальнейшем культивировании микроклонов на питательной среде МС со стандартным содержанием ZnSO4 × 7H2O (8,6 мг/л) (I пассаж) в течение 33 сут выявлено, что токсическое влияние тяжелого металла сохранилось, однако растения выглядели менее угнетенными, что выразилось в увеличении показателей морфологического развития (табл. 2). Некото- рое превышение над контролем числа междоузлий и листьев по исследуемым вариантам связано с тем, что у многих испытуемых растений на данном этапе опыта появились морфологические изменения: нижние листья были собраны в розетку, при этом наблюдалось уменьшение листовых пластинок в размере, а стебли укорачивались.

Таблица 2

5 аз m ® g “So 8 °	5 о 05   - 1— К О s о I z Ф	И3 Ф 5		® S I ! о s 2 До H C[ s <0	it I	Окраска листьев
Изумруд in vitro после CuSO 4 × 5H 2 O 161 мг/л
Контроль	17,1±2,4 c	5,9±0,9 ab	6,9±0,9 a	10,6±1,2 c	+	Зеленые
808 мг/л	14,2±4,1 bc	6,9±2,1 b	9,8±3,3 a	10,0±1,8 c	+	Зеленые
909 мг/л	10,7±6,0 b	7,4±1,5 b	12,8±5,4 a	7,6±1,9 b	–	Зелено-желтые
1010 мг/л	8,6±4,3 ab	6,8±1,0 b	13,0±5,4 a	7,5±1,8 b	–	Зелено-желтые
1111 мг/л	10,1±3,9 b	7,3±1,4 b	11,5±3,9 a	7,3±2,0 b	–	Зелено-желтые
1212 мг/л	7,3±5,6 ab	6,5±2,5 ab	12,6±5,6 a	6,2±2,3 ab	–	Зелено-желтые
1313 мг/л	4,2±3,4 a	4,9±2,8 a	9,7±6,1 a	4,8±1,9 a	–	Зелено-желтые
Изумруд in vitro после CuSO 4 × 5H 2 O 184 мг/л
Контроль	16,5±2,8 c	5,8±1,0 b	6,8±1,1 a	12,8±0,8 d	+	Зеленые
808 мг/л	16,3±3,4 c	7,2±1,1 b	10,1±2,4 abc	11,0±1,2 cd	+	Зеленые
909 мг/л	16,0±4,8 c	7,9±1,2 b	13,6±6,7 d	9,2±1,8 bc	+	Зеленые
1010 мг/л	13,6±3,3 c	7,8±0,6 b	12,6±2,2 cd	7,9±1,9 b	–	Зелено-желтые
1111 мг/л	7,7±4,2 b	7,3±1,7 b	11,5±3,6 bcd	7,5±1,4 b	–	Зелено-желтые
1212 мг/л	8,9±5,6 b	6,8±2,2 b	9,3±3,7 ab	8,5±2,9 b	–	Зелено-желтые
1313 мг/л	5,3±4,0 a	5,0±3,1 a	8,6±4,4 ab	5,3±2,5 a	–	Зелено-желтые

Морфологические показатели регенерантов гречихи на питательных средах МС после меди и цинка

Необходимо отметить, что у линий, полученных в результате последовательного отбора на средах с ТМ при использовании более высокой дозы CuSO4 × 5H2O (184 мг/л), ризогенез наблюдался на двух исследуемых вариантах последействия соли цинка (808–909 мг/л). В то же время у регенерантов, созданных на селективных средах со 161 мг/л соли меди, выявлена меньшая устойчивость к металлическому стрессу – корнеобразование наблюдалось только после культивирования на средах с 808 мг/л сульфата цинка. В итоге выживаемость генотипов, прошедших отбор в селективных системах с более высокой дозой соли меди (184 мг/л), на всех вариантах опыта с Zn2+ составила 100 %, а после 161 мг/л Cu2+ – не выжило 3 % микрорастений. Таким образом, подтверждается факт, что повышенная резистентность к одному стрессору может приводить к увеличению устойчивости к другому [10].

Проявления токсического стресса у полученных микрорастений полностью исчезли при последующем культивировании на питательных средах без токсиканта (II пассаж на МС) (рис.). Морфологические показатели регенерантов по вариантам слабо различались от контроля и между собой. Ризогенез у растений наблюдался на всех вариантах.

CuSO4 х 5Н2О (161 мг/л)

Контроль     808 мг/л     909 мг/л     1010 мг/л    1111 мг/л    1212 мг/л    1313 мг/л

СuSO4 x 5H2O (184 мг/л)

I j i j u j i j i j u

Контроль     808 мг/л     909 мг/л     1010 мг/л    1111 мг/л    1212 мг/л    1313 мг/л

• ■ Высота растения, см ■ Число междоузлий, шт. ■ Число листьев, шт. ■ Длина листовой пластинки, мм

Рис. 1. Морфологические показатели регенерантов гречихи, полученных в результате последовательного отбора на селективных средах с медью и цинком (II пассаж на МС)

Ранее нами указывалось на толерантность клеточно-тканевых культур и микропобегов гречихи посевной к повышенным концентрациям сульфатов меди и цинка in vitro [4]. По мнению N.K. Chrungoo et al. [11], гречиха имеет широкий экологический диапазон пластичности, и, следовательно, она может хорошо расти практически при любых неблагоприятных условиях.

Заключение. Гречиха посевная является культурой весьма пластичной и устойчивой к длительному воздействию высокотоксичных доз цинка, о чем свидетельствует большой процент выживших на селективных средах растений (97–100 %) и быстрое послестрессовое восста- новление исследуемых микроклонов. Регенеранты, полученные в результате последовательного отбора на средах с использованием более высоких концентраций меди, показывают повышенную устойчивость к цинку. Отобраны толерантные к токсической нагрузке Cu2+ и Zn2+ генотипы F. еsculentum, которые в дальнейшем могут быть использованы для создания сортов регенерантного происхождения с индуцированными новыми хозяйственно полезными признаками, в т. ч. адаптированных к неблагоприятным условиям почвенного стресса, обусловленного токсичностью тяжелых металлов.