Влияние содержания Fe3O4 в наночастицах Fe3O4-Fe со структурой ядро-оболочка на их противоопухолевую активность in vitro

Противоопухолевые препараты имеют высокую токсичность и провоцируют различные побочные эффекты. Применение наночастиц (НЧ) со средним размером менее 100 нм обусловлено их уникальными свойствами, такими как большая площадь поверхности, возможность диффузии в ткани и более низкая скорость осаждения [1]. В связи с этим разрабатываются новые материалы на основе НЧ железа и оксидов железа, позволяющие доставить лекарственные средства к месту поражения и сами по себе обладающие противоопухолевой активностью [2].

Разработанные системы доставки на основе магнитных НЧ позволили значительно улучшить результаты лечения, благодаря направленному воздействию на очаг поражения, способности регулировать скорость распада препарата и обеспечивать высвобождение лекарства с постоянной скоростью [3]. НЧ железа и его оксидов, в отличие от других магнитных металлов (кобальта и никеля), не обладают выраженной цитотоксичностью [4] и чаще всего используются как противоопухолевые агенты, а также для диагностики и визуализации [5].

Среди оксидов железа (гематит α-Fe2O3, магнетит Fe3O4 и маггемит γ-Fe2O3) для биомедицинского применения наиболее приемлемым является магнетит (Fe3O4) благодаря его биосовместимости, способности к биорезорбции и химической стабильности [6]. Уникальные магнитные свойства Fe3O4 объясняются тем, что он является ферримагнетиком и имеет кубическую структуру шпинели с плотной упаковкой, образующей гранецентрированную кубическую решетку [7]. Исследование возможности применения НЧ Fe3O4 в качестве самостоятельных противоопухолевых агентов проводится сравнительно недавно. Так, группа авторов [8] обнаружила пероксидазную активность НЧ Fe3O4 в условиях клеточного микроокружения. Данный механизм был подтвержден в работе [9] на примере клеточных линий HepG2 и A549. Авторы показали, что в основе механизма противоопухолевой активности наночастиц Fe3O4 лежит их способность генерировать активные формы кислорода (АФК), вызывая окислительный стресс и последующий апоптоз раковых клеток. Возможность применения НЧ Fe3O4 для генерации АФК в системе Фентона, содержащей перекись водорода H2O2, при терапии опухолей и химический механизм процесса продемонстрированы в работе [10]. Ионизация наночастиц оксида железа в слабокислой среде с выделением Fe2+ и их взаимодействие по реакции диспропорционирования с H2O2 приводили к образованию АФК, в основном в виде радикалов OH•, которые значительно снижали жизнеспособность опухолевых клеток за счет перекисного окисления липидов, разрыва цепей ДНК, мутации или транслокации на уровне ядер клеток [11]. Фотокаталитическая терапия опухолей с применением НЧ Fe3O4 также описана в работах [12, 13], однако в данном направлении необходимо проведение дополнительных исследований механизмов апоптоза в условиях клеточного микроокружения [14].

Важным параметром, обусловливающим противоопухолевую активность НЧ Fe3O4, является их размер. Установлено, что НЧ с размером 5 нм способны накапливаться в ядре клеток благодаря более быстрому высвобождению ионов железа Fe2+ [15]. Однако повышенная концентрация ионов железа Fe2+, проникающих в митохондрии, способствует клеточному апоптозу [11], что обеспечивает их выраженную цитотоксичность и в отношении нормальных клеток. Накопление ионов железа также способствует нейродегенеративным заболеваниям, связанным с агрегацией белков Аβ и α-синуклеина [16]. Таким образом, возможность контроля выделения ионов Fe2+ является важным критерием при разработке противоопухолевых агентов на основе НЧ Fe3O4.

Цель исследования – разработка наночастиц Fe₃O₄-Fe с противоопухолевой активностью in vitro .

В работе были получены магнитные НЧ Fe3O4-Fe с различным содержанием оксида Fe3O4. Применение такой системы, образующей гальваническую пару в физиологических жидкостях, позволит контролировать выделение токсичных ионов железа и, соответственно, активность наночастиц. Исследованы физико-химические свойства полученных наночастиц и их противоопухолевая активность в отношении клеточных линий MCF-7 и HeLa.

Материал и методы

Наночастицы Fe3O4-Fe получали электрическим взрывом железной проволоки в смешанной атмосфере аргон + кислород по ранее описанной методике [17]. Регулирование содержания оксида железа в наночастицах Fe3O4-Fe осуществляли изменением содержания кислорода и аргона в газовой смеси в соответствии с табл. 1.

Для исследования структуры НЧ использовали метод рентгеноструктурного анализа (РСА), рентгеновский дифрактометр Shimadzu XRD 6000, Япония. Размер частиц исследовали седиментационным методом с применением дисковой центрифуги CPS 24000 (CPS Disc Instruments, США). Текстуру НЧ исследовали методом тепловой десорбции азота на анализаторе Сорбтометр М, Россия. Удельную поверхность рассчитывали методом БЭТ [18]. Для оценки морфологии НЧ использовали просвечивающую электронную микроскопию (JEM-2100, Япония) со встроенной

Таблица 1/Table 1

Условия получения НЧ Fe-Fe3O4

Conditions for obtaining Fe-Fe3O4 nanoparticles

Образец/ Sample	Содержание Fe3O4, масс. %/ Fe3O4, mass ratio, %	Содержание O2в газовой смеси, об. %/ O2 content of in the gas mixture), vol. %	Содержание Ar в газовой смеси, об. %/ Ar content of in the gas mixture), vol. %
Fe3O4(5)-Fe	4	1,00	99,00
Fe3O4(20)-Fe	20	1,30	98,70
Fe3O4(40)-Fe	35	1,75	98,25
Fe3O4(90)-Fe	91	5,00	95,00

Рис. 1. Электронно-микроскопическое изображение НЧ Fig. 1. TEM-image of nanoparticles

приставкой энергодисперсионного анализа XMax. Измерения дзета-потенциала образцов проводили методом микроэлектрофореза с использованием анализатора Zetasizer Nano ZSP, Великобритания.

Противоопухолевую активность НЧ исследовали при помощи МТТ-теста на эпителиоподобной культуре клеток аденокарциномы протоков молочной железы MCF-7 (ATCC HTB-22) и клеточной линии HeLa, выделенной из опухоли шейки матки, предоставленных ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия). Предварительно получали экстракты НЧ после деградации в течение 24 ч при 37 °Ϲ в физиологическом растворе NaCl (0,9 масс. %) в соответствии с ГОСТом [19]. Клетки предварительно культивировали при 37 °Ϲ в атмосфере 5 % CO2/95 % воздуха (СО2-инкубатор Sanyo, Япония) в среде DMEM (HiClone) с добавлением 5 % сыворотки эмбрионов коров и гентамицина. После инкубирования клетки помещали в 12-луночные культуральные планшеты в количестве 500 тыс. клеток/лунка и добавляли экстракты из расчета 10 мкл экстракта на 1000 мкл среды. Через 24 ч инкубирования цитотоксичность экстрактов оценивали при помощи МТТ-теста. Процедура проведения МТТ-теста детально описана в протоколе [20], определение оптической плотности проводили при длине волны 540 нм с использованием планшетного спектрофотометра (Multiscan FC, Thermo Scientific, США).

Результаты

В результате электрического взрыва железной проволоки в газовой смеси аргон + кислород, содержащей кислород в диапазоне 1‒5 об. %, были получены НЧ Fe3O4-Fe с 5‒90 масс %. Fe3O4 соответственно. Характерные электронномикроскопические изображения НЧ приведены на рис. 1.

В образце Fe3O4(5)-Fe наблюдалось небольшое число частиц, имеющих шестиугольную и прямоугольную формы, все частицы в основном были сферическими. Увеличение содержания кислорода при получении НЧ до 1,3 об. % (образец Fe3O4(20)-Fe) приводило к резкому увеличению количества НЧ с отклонениями от сферической формы, наблюдалось большое количество частиц шестиугольной и прямоугольной формы. Дальнейшее увеличение содержания Fe3O4 в НЧ приводило к увеличению количества сферических НЧ. Основные физикохимические характеристики синтезированных НЧ приведены в табл. 2.

Противоопухолевую активность НЧ Fe3O4-Fe исследовали на линиях клеток HeLa и MCF-7. Клеточная линия HeLa выделена из опухоли шейки матки. MCF-7 – это эпителиоподобная культура клеток аденокарциномы протоков молочной железы. Данными, полученными при помощи МТТ-теста, установлено, что с увеличением концентрации НЧ происходит равномерное снижение количества жи-

Таблица 2/Table 2

Удельная поверхность (S_уд), средний размер частиц (a_n), фазовый состав и дзета-потенциал ( ζ ) НЧ Fe₃O₄-Fe

Specific Surface area (SSA), average particle size (an), phase composition and zeta-potential (ζ) of Fe3O4-Fe Nps

Образец/ Sample	Sуд, м2×г-1/ SSуA, m2×g-1	an , нм/ an , nm	Фазовый состав, a Fe	масс. %/Phase co Fe3O4	mposition wt. % FeO	ζ, мВ/ ζ, mV
Fe3O4(5)-Fe	10,3 ± 0,4	68 ± 2	95,7	4,3	–	-29,4 ± 0,2
Fe3O4(20)-Fe	7,5 ± 0,7	81 ± 5	80,3	19,2	0,4	-30,7 ± 0,5
Fe3O4(40)-Fe	8,2 ± 0,7	78 ± 3	60,4	38,9	0,7	-28,5 ± 0,3
Fe3O4(90)-Fe	11,4 ± 0,1	65 ± 2	8,3	90,7	1	-28,2 ± 0,3

Примечание: ± стандартное отклонение для n=3 при определении удельной поверхности (S_уд) и дзета-потенциала (ζ) образцов; n=5, для определения среднего размера частиц ( a_n ).

Note: ±SD n=3 for SSA and zeta-potential of samples; n=3 for average particle size ( a_n ).

Рис. 2. Жизнеспособность клеточных линий HeLa (a) и MCF-7 (б) в присутствии НЧ Fe3O4-Fe, рассчитанная в % относительно контроля.

Примечание: вертикальные линии обозначают ±стандартное отклонение, n=5 для всех протестированных образцов Fig. 2. HeLa (a) and MCF-7 (b) cell viability in the presence of Fe3O4-Fe NPs, calculated in % relative to control.

Note: vertical lines represent ±SD, n=5 for all tested samples

Рис. 3. Фотографическое изображение клеточной линии MCF-7 до (а) и после (б) контакта с НЧ Fe3O4(5)-Fe Fig. 3. MCF-7 cell line images before (a) and after (b) Fe3O4(5)-Fe NPs contact

вых клеток. При концентрации наночастиц 1 мг/мл количество живых клеток линии HeLa составляло около 60 % относительно контрольного образца, не обработанного экстрактом НЧ (рис. 2а).

Линия MCF-7 проявила большую чувствительность к воздействию НЧ (рис. 2б). В отличие от линии HeLa, наименьшей цитотоксичностью обладали НЧ Fe3O4(90)-Fe. При концентрации наночастиц 1 мг/мл наблюдалось снижение жизнеспособности клеток до 40 % относительно контроля. Наибольшей цитотоксичностью обладали наночастицы Fe3O4(5)-Fe, в присутствии которых в концентрации 1 мг/мл количество живых клеток снижалось до 16 % относительно контроля. Фотографические изображения клеточной культуры MCF-7 до (рис. 3а) и после (рис. 3б) контакта с НЧ демонстрируют значительное снижение количества распластанных клеток, что подтверждает негативное воздействие НЧ на клетки.

Обсуждение

Исследование структурных характеристик НЧ показало, что основными фазами в НЧ Fe3O4-Fe являются магнетит Fe3O4, который является двойным оксидом (Fe2O3×FeO) со структурой шпинели, и металлическое железо. Кроме того, в образцах обнаруживаются следовые (менее 1 %) количества оксида железа (II) FeO (вюстита), который является термодинамически нестабильной фазой и при температурах менее 560 °С претерпевает эвтектоидный распад с образованием Fe и Fe3O4 [21]. Наличие вюстита в образцах, вероятно, объясняется быстрым охлаждением расширяющихся продуктов электрического взрыва со скоростью до 107–109 К/с [22].

Дзета-потенциал НЧ не зависел от содержания Fe₃O₄ в НЧ и составлял ≈ -30 мВ. Зависимости основных физико-химических параметров НЧ (удельная поверхность S _уд, средний размер a_n ) от массовой доли Fe₃O₄ W в НЧ приведены на рис. 4.

Такое изменение физико-химических свойств НЧ с экстремумом при содержании Fe3O4 W=20 % можно объяснить механизмом образования оксидной фазы при электрическом взрыве. При малом содержании кислорода в газовой смеси (1,0 об. %) экзотермический эффект реакции окис-

Рис. 4. Экспериментальные зависимости удельной поверхности ( S _уд) и среднего размера ( a_n ) НЧ от массовой доли (W) Fe₃O₄ в НЧ Fe₃O₄-Fe

Fig. 4. Experimental curves of dependence of specific surface (SSA) and average particle size (an) on Fe3O4 mass ratio (W)

Рис. 5. ПЭМ-изображение (a) и энергодисперсионный анализ (б) в режиме картирования по линии НЧ Fe3O4(20)-Fe Fig. 5. TEM image (a) and energy-dispersive analysis (b) in the mode of mapping along line of Fe3O4(20)-Fe NPs

ления железа был небольшим, формирование Fe3O4 в образце Fe3O4(5)-Fe в основном происходило за счет диффузии кислорода в объем металла. Содержание Fe3O4 в данном образце было наименьшим. Увеличение содержания кислорода до 1,3 об. % при получении образца Fe3O4(20)-Fe приводило к испарению железа с поверхности основной массы жидких наночастиц. Взаимодействие железа с кислородом происходило в данных условиях в тонком слое газовой фазы, прилегающем к поверхности наночастиц. На поверхности железных наночастиц формировался слой FeO, который при охлаждении дисперсной системы, согласно фазовой диаграмме, распадался на α-Fe и Fe3O4. Для данного образца наблюдались изменение морфологии НЧ и наибольшее количество НЧ ограненной и квадратной формы. Структура ядро-оболочка для данных НЧ была также подтверждена при помощи энергодисперсионного анализа, приведенного на рис. 5.

Дальнейший рост содержания кислорода до 1,75 об. % увеличивал экзотермический эффект реакции и приводил к полному испарению наиболее мелких наночастиц. В данном случае формирование наночастиц происходило в соответствии с двумя механизмами: 1) часть НЧ формировалась непосредственно из газовой фазы, что обеспечивает их сферическую форму, и была представлена только Fe3O4; 2) другая часть наночастиц образовывалась при формировании оболочки из FeO вокруг металлического ядра из газовой фазы, которое распадалось при охлаждении на α-Fe и и Fe3O4. С увеличением содержания кислорода до 5 об. % количество НЧ, формирующихся по первому механизму, увеличивалось. Таким образом, увеличение содержания кислорода в газовой смеси приводит сначала к росту количества НЧ со структурой ядро-оболочка. Их максимальное содержание достигалось для НЧ Fe3O4(20)-Fe. Дальнейшее увеличение содержания кислорода приводило к увеличению содержания НЧ оксида железа Fe3O4.

Влияние НЧ на жизнеспособность опухолевых клеточных линий определяли в широком диапазоне

Рис. 6. Влияние массовой доли Fe3O4 в НЧ Fe3O4-Fe на жизнеспособность клеточных линий

• Fig. 6.    Effect of Fe3O4 mass ratio on the cell viability

  
  
  

Рис. 7. Влияние магнитного момента (σ) НЧ Fe3O4-Fe на жизнеспособность клеточной линии MCF-7

• Fig. 7.    Effect of the Fe3O4-Fe NP magnetic moment (σ) on the MCF-7 cell viability

концентраций наночастиц в течение 24 ч инкубирования при помощи МТТ-теста. МТТ является основным методом оценки цитотоксичности биоматериалов [23]. Метод основан на способности дегидрогеназы митохондрий живых клеток восстанавливать бромид тетразолия до пурпурных кристаллов формазана, количество которых коррелирует с количеством живых клеток.

Как показали проведенные исследования, в присутствии НЧ наблюдалось снижение пролиферации, которое нелинейно зависело от содержания Fe3O4в НЧ. Зависимость жизнеспособности клеточных линий от содержания Fe3O4 в образцах приведена на рис. 6.

R.A. Petros et al. установлено, что транспорт НЧ через мембрану опухолевых клеток в значительной степени определяется их размером и оптимальными являются НЧ с размером 50–70 нм [24]. Помимо эффективного поглощения НЧ важна также возможность их удержания, частицы менее 50 нм подвергаются экзоцитозу в течение 24 ч по- сле поглощения [25]. Полученные нами данные по жизнеспособности культуры HeLa (рис. 6) хорошо коррелировали со средним размером НЧ (рис. 4). Снижение размера частиц приводит и к увеличению выделения ионов Fe2+, которые, по данным [26], нарушают синтез ДНК опухолевых клеток, что вносит основной вклад в снижение их пролиферации.

Однако подобной корреляции не наблюдалось в отношении клеточной линии MCF-7. Как показано на рис. 6, данная линия обладала высокой чувствительностью к НЧ при высоких концентрациях НЧ. Жизнеспособность клеточной линии снижалась с уменьшением количества в Fe3O4 НЧ. При построении зависимости магнитных свойств НЧ (магнитного момента) наблюдалась практически линейная зависимость с высоким коэффициентом корреляции (рис. 7).

Насколько нам известно, такая зависимость наблюдалась впервые и требует проведения дополнительных исследований в экспериментах in vivo .

Чувствительность клеточной линии HeLa к магнитному моменту НЧ не носила линейного характера, однако для НЧ с наибольшим магнитным моментом (182 emu/g) характерно наибольшее подавление жизнеспособности клеток (48 %). Полученный в работе эффект позволит регулировать свойства синтезированных НЧ под действием внешнего магнитного поля и делает их перспективными при использовании в качестве медиаторов гипертермии при лечении онкологических заболеваний.

Заключение

С каждым годом все больше растет интерес исследователей к применению магнитных НЧ оксидов железа в различных биомедицинских приложениях, включая разделение клеточных смесей, выделение антител, создание биосенсоров и биочипов, магнитно-резонансную томографию и т. д. Способность железа к комплексообразованию