Влияние сосновой хвои на окислительные процессы и активность антиоксидантных ферментов в плазме крови кролика европейского (Oryctolagus cuniculus)

Сосновая хвоя относится к типичным недревесным лесным ресурсам и часто не используется. Однако имеются данные по её применению в кормлении животных, в том числе кроликов [Боярский, 1988]. Хвоя сосны по содержанию белка, экстрактивным веществам и жиру превосходит сено, уступая ей только в зольности [Попов, 1966]. Переваривание и усвоение хвои колеблется в пределах 25–80%. Она содержит каротины, ксантофиллы, хлорофиллы, фитостерины, аскорбиновую кислоту, (витамин С), токоферолы (витамин Е), витамины группы В, К [Томмэ, 1963; Попов, 1966].

Особое место среди биологически активных веществ хвои занимают фенольные соединения [Mannila, 1993; Кочетова и др., 2007]. Они участвуют в процессах, противодействующих окислительному стрессу, их концентрация выше в больных деревьях по сравнению со здоровыми. По-видимому, фенольные соединения и другие вещества хвои сосны могут оказывать действие на окислительные процессы. К ним относятся: окислительная модификация белков (ОМБ) [Игуменов, Шаров, Пасечник, 1988; Арчаков, Мохосоев, 1989; Дубинина; 2006], перекисное окисление липидов (ПОЛ) [Барабой, 1991; Владимиров, Арчаков, 2003; Gutteridge, 2005] и активность антиокси-

дантных ферментов, которые утилизируют активные формы кислорода (АФК) тем самым снижая окислительный стресс [Stocker, Frei, 1991; Meral, Tuncel, Surmen-Gur, 2000].

Рацион питания оказывает прямое действие на рост и развитие животных, в том числе на привес, здоровье, качество продукции, процессы биологического окисления [Тарасов, Корягин, 2017]. Безусловно, окислительные процессы, происходящие в организме животных, оказывают влияние на физиолого-биохимические показатели, что сказывается на качестве итоговой продукции. В связи с чем цель работы – изучение влияния питания сосновой хвоёй на ОМБ, ПОЛ, активность СОД и каталазы.

Материалы и методы исследования

Материал

Исследования проводили на здоровых кроликах породы «Советская шиншилла» в возрасте от 3 до 5 месяцев, которые были выделены из общего стада и в течение двух недель питались в соответствии со своими рационами. Рацион животных включал: зерносмесь ячменя, овса и пшеницы, сено из лугового разнотравья, воду. Опытным животным в состав сена добавляли молодые ветки сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris ) в количестве 50% от общей массы грубого корма. Контролем служили животные, грубым кормом которых являлось 100%-ное сено из лугового разнотравья. Все животные имели в неограниченном количестве корма соответствующего рациона, т.е. могли потреблять столько корма, насколько была велика их физиологическая потребность. Всего в эксперименте было задействовано 14 животных, 7 – в опытной и 7 – в контрольной группах. Забор крови проводили из ушной вены через 1, 3, 7 и 14 сут. после смены рациона питания. Через такой же период времени забор крови проводили и у животных контрольной группы. Для получения плазмы кровь смешивали с антикоагулянтом и центрифугировали при 3000 g.

Методы исследования

Уровень малонового диальдегида определяли методом, основанным на взаимодействии его с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Стальная, Га-ришвили, 1977]. Содержания диеновых конъюгатов в плазме крови проводили путём добавления к 0.2 мл плазмы 2 мл смеси изопропанол/гептан (1:1) [Каган, Орлова, Прилипко, 1986]. Активность СОД устанавливали по методике, основанной на способности нитросинего тетрозолия конкурировать с СОД за супероксидный анион радикал [Дубинина и др., 1986]. Активность каталазы определяли по методу, основанному на способности дан- ного фермента разлагать перекись водорода с образованием воды [Patterson et al., 1984]. Концентрацию карбонильных производных в плазме крови кролика устанавливали по модифицированной методике Дубининой [Дубинина и др., 1995]. Общий белок определяли биуретовым методом (метод Кингслея – Вейксельбаума) [Мельников, 1987]. Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью программы Microsoft Excel 2003 и Биостатистика вер. 4.03 методами параметрической статистики, включающей определение средней арифметической (М) и стандартного отклонения. Достоверность различий оценивали по t критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони. Уровень значимости достоверных различий – 95% [Гланц, 1999].

Результаты и их обсуждение

При исследовании влияния питания хвоей сосны на процессы ОМБ установлено, что после вве- дения в рацион данного компонента, содержание продуктов ОМБ снижается (рис. 1). Снижение 2,4-денитрофенилгидразонов планомерное и происходит наиболее резко в течение первых трех суток (Р≤0,05).

Рис. 1 . Изменение уровня ОМБ в плазме крови кролика при добавлении в рацион сосновой хвои в составе грубых кормов:

АН – алифатические альдегид-денитрофенил-гидразоны нейтрального характера, АО – алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны основного характера, КН – алифатические кетон-денитрофенилгидразоны нейтрального характера, КО – алифатические кетон-денитрофенил-гидразоны основного характера, К – контроль, 1Д, 3Д, 7Д, 14Д – период забора крови после начала эксперимента

С введением в рацион кролика хвои сосны наблюдается отчётливая картина снижения продуктов ПОЛ уже на третьи сутки (рис. 2). При этом зафиксировано снижение ДК на третьи и седьмые сутки, а МДА – на третьи сутки, последующие изменение не наблюдалось (Р≤0.05). Анализируя полученные данные, авторы статьи убедились, что после проведения эксперимента концентрация продуктов ПОЛ становится существенно ниже по отношению к контролю.

Добавление хвои сосны в рацион питания приводит к незначительному росту СОД на третий день после смены рациона; при дальнейших наблюдениях за активностью данного фермента установлено статистически значимое снижение до уровня ниже контроля примерно на 25%. (Р≤0.05) (рис. 3).

Рис. 2 . Влияние сосновой хвои в составе грубых кормов на ПОЛ в плазме крови кролика:

ДК – диеновые конъюгаты, МДА – малоновый диальдегид, прочие обозначения см. на рис. 1

пов, 1966; Giertych, Werner, 1996; Фуксман и др., 2005]. Она содержит в значительном количестве аскорбиновую кислоту, токоферолы, каротины, ксантофиллы, полифенолы, являющиеся низкомолекулярными антиоксидантами, способными в значительной степени улавливать АФК в плазме крови и не давать им прореагировать с белковыми молекулами (таблица).

Рис. 3 . Влияние сосновой хвои в составе грубых кормов на активность антиоксидантных ферментов:

СОД – супероксиддисмутаза, кат – каталаза, прочие обозначения см. на рис. 1

Снижение уровня ОМБ, вероятно связано с особенностями биохимического состава хвои [По-

Основные антиоксидантные вещества в составе хвои сосны обыкновенной ( Pinus sylvestrs ) и их антиоксидантные свойства

Вещество	Химическая структура	Антиоксидантные свойства
Аскорбиновая кислота (витамин С)	HO-C H—у—1 HO-C-H CH,OH	Под действием аскорбатоксида-зы реагирует с АФК с образованием дигидроаскорбата и воды.
Токоферолы (витамин Е)	Ri h°yVx Ri	Гидроксильный радикал фенольного кольца реагирует с АФК. Возможны реакции метильных радикалов с образованием производных.
Каротины (про витамин А)	i^'"65-^^^	Взаимодействие с АФК с разрывом молекулы и образованием производных, например ре-тиналя, ретиноевых кислот, ретинола и пр. Возможны реакции присоединения АФК к кольцу и метильным радикалам.
Ксантофиллы		Аналогично каротинам, однако ввиду насыщенности «О» обладают меньшей специфичностью к АФК.
Полифенолы	OR! T T T ^^r^X]f/^'OR3 or4 0	Взаимодействуют с АФК за счёт гидроксильных радикалов. В кислой среде возможны реакции разрыва бензольного кольца и взаимосвязь углеродного скелета с АФК.

Кроме этого, организм животных регулярно вырабатывает внеклеточные протеазы, расщепляющие окисленный белок плазмы крови, а низ- комолекулярные антиоксиданты препятствуют его новообразованию, поэтому через две недели наблюдается существенное снижение продуктов

ОМБ. При применении обычных комбикормов данный эффект не наблюдается, т.к. они не содержат в своём составе низкомолекулярные антиоксиданты.

Снижение уровня ПОЛ, также как и ОМБ, можно объяснить меньшей концентрацией АФК в плазме крови ввиду их утилизации низкомолекулярными антиоксидантами (таблица). Полученные данные изменения уровня ОМБ и ПОЛ свидетельствуют о снижении процессов окислительной деструкции данных биополимеров в зависимости от наличия в рационе хвои сосны.

Увеличение активности СОД в первый день, вероятно, связано со сменой рациона питания, что обусловлено особым биохимическим составом хвои. Динамика каталазы статистически значимо не изменяется (Р≥0.05), что может быть обусловлено тем, что утилизируемые ей АФК – Н2О2 не генерируются клетками крови в большом количестве в нормальных условиях, а антиоксидантные вещества хвои утилизируют АФК первого уровня, которые дезактивирует СОД.

Так, установлено, что аскорбиновая кислота способна вступать в реакцию с различными формами кислорода, в том числе и с АФК (О 2 ^- , О^2-, О 2 ^S*) под действием аскорбатоксидазы превращается в дигидроаскорбиновую кислоту с образованием воды (рис. 4), т.е. атомы АФК реагируют с Н⁺ аскорбиновой кислоты и тем самым дезактивируются [Santagostini et al., 2004].

Каротины, ксантофиллы и токоферолы представляют собой полиеновые углеводороды в большинстве своём с одним или двумя циклогексеновыми концами, тем самым АФК способны разрывать двойные связи и встраиваться в углеводородный скелет [Perchyonoka, 2013] (рис. 5).

Аскорбиновая кислота

НО-С-Н Т сн.он

Дсгилроаскорбиновая кислота

Рис. 4 . Возможная реакция взаимодействия аскорбиновой кислоты с некоторыми АФК под действием аскорбатоксидазы

Рис. 5 . Наиболее вероятные участки взаимодействия АФК с неферментативными антиоксидантами, содержащиеся в составе сосновой хвои

Полифенолы способны реагировать с АФК посредством гидроксильных групп также за счёт разрушения sp2 гибридизации бензольного кольца. Однако последние реакции возможны только в кислой среде, т.к. разрушение бензольного кольца возможно только замещением протонами с последующей реакцией с АФК [Bruneton, 1993.].

Таким образом, антиоксиданты хвои снижают общую концентрацию АФК и тем самым уменьшают вероятность встречи их с биополимерами плазмы крови, что отмечено в результате исследо- ваний (см. рис. 1, 2). Снижение активности СОД, вероятно, связано со снижением АФК в плазме, а также информационным взаимодействием структур ткани, где мессенджерами являются свободные радикалы [Донцов и др., 2006].

Выводы

• 1.    Установлено снижение уровня окислительной модификации белков в плазме крови кролика при добавлении в рацион хвои сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris ) по сравнению с сеном. Так, к 14 суткам кормления хвоей наблюдается снижение всех продуктов окислительной модификации не менее чем на 40% по отношению к контролю.

• 2.    Наблюдается снижение перекисного окисления липидов при добавлении в рацион хвои сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris ), чего не присходит при кормлении сеном. Продукты перекисного окисления липидов снижаются более чем на 45% по отношению к контролю.

• 3.    Зафиксировано небольшое увеличение активности супероксиддисмутазы на третьи сутки после смены рациона с последующим снижением примерно на 25% по отношению к контролю.

• 4.    Динамика активности каталазы статистически значимо не изменялась на протяжении времени эксперимента.