Влияние совместного действия голодания и меди на антиоксидантную систему Crenomytilus grayanus (Dunker, 1853)

Растущее загрязнение морской среды отходами производства, нефтепродуктами, пестицидами и тяжелыми металлами влияет на жизнедеятельность гидробионтов и тем самым нарушает сложившееся природное равновесие в экосистеме моря. Одним из таких повреждающих агентов является медь, которая относится к эссенциальным элементам и необходима для метаболизма, роста и развития всех живых организмов, однако в повышенных концентрациях медь может оказывать сильное токсическое действие, особенно увеличивающееся в условиях недостатка кислорода [15, 31].

Известно, что в норме в клетках и тканях аэробных организмов всегда образуются активные формы кислорода (АФК) - О2-•, Н2О2, ОН• и др. Эти соединения высокореактивны и вызывают окислительное повреждение биологически важных молекул, таких как ДНК, белков, липидов. У всех организмов присутствует антиоксидантная система, представленная специфическими ферментами и низкомолекулярными компонентами (антиоксидантами), которая сдерживает разрушительное действие АФК. Разнообразные факторы, например экстремальные абиотические факторы среды, такие как гипоксия или чу-

жеродные химические вещества органической и неорганической природы (поллютанты) усиливают генерацию АФК, в результате чего нарушаются механизмы функционирования биохимических систем, что неизбежно ведет к развитию окислительного стресса.

Показано, что одним из патогенетических механизмов действия меди является окислительный стресс [17]. Так ионы Cu2+, восстанавливаясь в клетке до Cu+ в присутствии биологических восстановителей таких как аскорбиновая кислота и глутатион, могут способствовать образованию супероксидного анион радикала О2•- [16] и/или через реакцию Фентона генерировать один из самых реакционных свободных радикалов - гидроксильный радикал (OH•) [39]. Усиление образования радикалов кислорода приводит к окислительному повреждению всех биологических молекул, в том числе липидов, белков и нуклеиновых кислот [21]. Кроме того, ионы меди способны непосредственно взаимодействовать с тиоловыми группами глутатиона и клеточных белков и влиять на окислительновосстановительное состояние в клетках [9; 16].

Поэтому выживаемость организма в условиях возникновения окислительного стресса зависит от потенциалаего антиоксидантной системы.

Воздействие химических веществ различной природы на морские организмы происходит в условиях периодического колебания биотических и абиотических факторов, таких как доступность пищи, температура, соленость, доступность кислорода. Воздействие такого комплекса факторов среды может оказывать значительное влияние на физиологическое состояние морских организмов и должно учитываться при использовании их в качестве мониторов при оценке качества окружающей среды [18]. В ряде работ показано, что повреждающий эффект некоторых токсичных веществ, в частности тяжелых металлов, усиливается на фоне изменений естественных факторов среды [13, 19, 22, 26, 35].

Сублиторальный двустворчатый моллюск Crenomytilus grayanus в последнее время широко используется в качестве организма индикатора в полевых исследованиях, связанных с биоаккумуляцией таких токсикантов как тяжелые металлы, хлорорганические пестициды, радионуклиды [2, 25, 38]. Мидия Грея способна аккумулировать повышенные концентрации меди в зависимости от содержания металла в морской среде [24]. Кроме того, процессы сезонной флуктуации биомассы первичной продукции, а также интенсивное взмучивание осадков морского дна во время штормов и терригенных стоков могут приводить к периодам недостатка кислорода или пищи при закрытии створок раковины моллюска.

Цель данной работы состояла в том, чтобы оценить антиоксидантный потенциал мидии при аккумуляции ионов меди в условиях голодания.

Для оценки состояния антиоксидантной системы была определена активность суперок-сиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы. Для более полной характеристики антиоксидантной системы в тканях также были исследованы уровень интегральной антирадикальной активности низкомолекулярных антиоксидантов и концентрация восстановленного глутатиона, одного из важнейших низкомолекулярных антиоксидантов. Степень развития окислительного стресса в клетках оценивали по уровню накопления продуктов перекисного окисления липидов – малонового диальдегида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Половозрелые особи мидии Грея (с длиной раковины 10–11 см) были собраны в б. Алексеева (о-в Попова, залив Петра Великого Японского моря) в июле. Моллюсков для акклимации предварительно выдерживали в аэрируемых 140-литровых аквариумах с морской водой в течение недели. В аквариумах поддерживалась относительно стабильная температура (120С) и соленость (32%). Животных не кормили, воду меняли ежедневно.

Эксперимент 1. Влияние голодания

Мидий после акклимации выдерживали 2 недели без пищи при тех же условиях.

Эксперимент 2. Воздействие меди на фоне голодания

Животных после акклимации выдерживали в воде с CuSO4 (25 мкгCu/л) в течение 2-х недель без пищи при тех же условиях.

После проведения акклимации и экспериментов из каждого моллюска (всего было использовано 21 мидия) на льду извлекали пищеварительную железу. Для определения биохимических параметров большую часть ткани сразу гомогенизировали в охлажденном Трис-НСl буфере в соотношении 1:10 г/мл (0.05 М, рН 8.0, 40С), содержащем 0.1 мМ фенилме-тансульфонилфторид (ингибитор протеаз). Часть полученного гомогената использовали для определения содержания малонового диальдегида (МДА) [8] и уровня интегрального антиоксидантного потенциала низкомолекулярного звена антиоксидантной системы (ИАА) [6]. Остальную часть гомогенатов центрифугировали в течение 40 минут при 11000 об/мин и температуре 40С. Полученные супернатанты замораживали при температуре –80ºС (не более двух суток), затем определяли содержание белка [27] и активность антиоксидантных ферментов [32, 33].

Оставшуюся часть ткани, извлеченной из мидий, замораживали при температуре –80ºС, для дальнейшего определения содержания глутатиона (ГSН) [30].

Все измерения проводили при 200С на спектрофотометре Shimadzu UV-2550 с термостатированной ячейкой. Полученные в ходе экспериментов данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (М±n), где n=5 (пищеварительная железа от одной мидии -одна проба).

Содержание меди в пищеварительной железе мидий определяли атомно-абсорбционным методом после минерализации тканей смесью концентрированных азотной и хлорной кислот в соотношении 1:3 по объему. Измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu AA-6800 в воздушно-ацетиленовом пламени в трех параллельных пробах (1 проба – объединение тканей от 2-х животных) (М±n, где n=3).

Статистическая обработка полученных результатов выполнена с использованием статистических средств приложения MS Office Excel. О достоверности изменений исследуемых параметров судили по различиям средних значений, используя критерий Стьюдента. В расчетах принят 5% уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперимент 1. Влияние голодания

При выдерживании моллюсков в условиях отсутствия пищи в течение двух недель произошло значительное снижение активности КАТ (в 2.2 раза), показателя общей антирадикальной активности – ИАА (в 1.7 раза) и уровня продуктов перекисного окисления липидов - МДА (в 2.5 раза), по сравнению с контролем (см. рис.), в то время как активность СОД и ГР осталась неизменной при этих условиях (см. рис.). Уровень низкомолекулярного антиоксиданта – глутатиона (ГSH) также остался неизменным (см. рис.).

Эксперимент 2. Воздействие меди на фоне голодания

При аккумуляции меди в течение 2-х недель содержание металла в пищеварительной железе C. grayanus увеличилось в 2 раза (с 32±1.3 до 66±15.4 мкг/г сухой массы). По сравнению с контролем аккумуляция меди на фоне отсутствия пищи в течение 2-х недель привела к снижению активности СОД, КАТ и ГР в 1.8, 3 и 1.6 раза, соответственно (см. рис.) и небольшому увеличению ИАА (в 1.3 раза) по сравнению с голодными мидиями. Наблюдалось сильное снижение уровня ГSH (в 2.8 раза) и МДА почти в 2 раза (см. рис.).

ОБСУЖДЕНИЕ

В полярных и умеренных климатических зонах из-за сезонной флуктуации биомассы первичных продуцентов морские беспозвоночные могут испытывать периоды низкой доступности пищи [43].

Так как большинство низкомолекулярных антиоксидантов и их предшественников в водных экосистемах продуцируются фотоавтотрофами (например, каротиноиды и витамины) и являются важными в диете гетеротрофов, в частности моллюсков – фильтраторов, то ограничение в питании может существенно повлиять на состояние антиоксидантной системы и снизить защитный потенциал этих животных [29].

Вероятно поэтому в наших экспериментах по голоданию (эксперимент 1) происходит значительное снижение уровня ИАА, отражающего потенциал низкомолекулярного звена антиоксидантной системы [6]. Несмотря на то, что отсутствие пищи замедляет процессы анаболизма, в экспериментах по голоданию наблюдается достоверное снижение только активности КАТ. Активность первичного фермента антиоксидантной защиты – СОД, нейтрализующего супероксидный анион радикал, и уровень глутатиона (ГSH) у голодающих мидий остались неизменными. Вероятно, в метаболизме мидии ГSH настолько важен в поддержании окислительно-восстановительного баланса, отвечающего за метаболическое состояние клетки, что

Рис . Активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутаза (СОД, ед.акт/мг белка); каталаза (КАТ, мкмоль/мин/мг белка); глутатионредуктаза (ГР, нмоль/мг белка); уровень интегральной антирадикальной активности низкомолекулярных антиоксидантов (ИАА, мкмоль/мг белка), содержание глутатиона (ГSH, нмоль/г сыр. веса) и малонового диальдегида (МДА, нмоль/мг белка) в пищеварительной железе Crenomytilus grayanus в условиях голодания и действия меди на фоне голодания.

Примечание: а – достоверные различия относительно контрольных мидий, б – достоверные различия относительно голодных мидий, в – достоверные различия относительно контрольных и голодных мидий (n=5, p<0,05)

его содержание поддерживается на уровне контроля даже через 2 недели голодания. При этом важно подчеркнуть, что активность ГР, фермента восстанавливающего окисленный глутатион (ГSSH), в этих условиях поддерживался на уровне контроля. Таким образом, есть все основания полагать, что при голодании, несмотря на ограниченность субстратных и энергетических ресурсов, двустворчатый моллюск C. grayanus проявляет способность поддерживать высокий уровень ряда ключевых компонентов антиоксидантной системы.

Снижение активности КАТ также было обнаружено Абели и коллегами [3] в жабрах моллюска Nacella concinna после одного месяца голодания. Также Ансалдо и соавторы сообщили, что отсутствие пищи во время недели акклимации антарктического моллюска N. concinna вызывало достоверное снижение активности СОД и КАТ в пищеварительной железе [4] .

Снижение уровня продуктов перекисного окисления липидов (МДА) в пищеварительной железе голодающих мидий в наших экспериментах, очевидно, является результатом замедления метаболических процессов и, соответственно, реакций свободнорадикального окисления. Низкое содержание МДА в нервных ганглиях также было обнаружено у голодающих легочных моллюсков Lymnaea stagnalis по сравнению с сытыми [36]. В работе Ансалдо и его коллег [5] также показано снижение уровня продуктов перекисного окисления липидов в пищеварительной железе N. concinna после недели голодания. Таким образом, голодание является важным естественным фактором, влияющим на различные показатели окислительного стресса.

Присутствие в морской среде загрязняющих веществ увеличивает продукцию АФК и влияет на защитные механизмы [7, 34]. Воздействие меди (эксперимент 2) на фоне голодания оказало гораздо более сильное ингибирующее влияние на антиоксидантные ферменты по сравнению с действием только голодания (эксперимент 1). Подавление активности антиоксидантных ферментов (СОД, КАТ и ГР) медью может быть связано как с влиянием этого металла на процессы синтеза ферментов, так и с изменением конформации ферментов под действием ионов меди [1, 10].

Снижение активности КАТ и ГР при воздействии меди также было обнаружено в пищеварительной железе Mytilus galloprovincialis [33] и в печени пресноводной рыбы Piaractus mesopotamicus [35].

Воздействие ионов меди вызвало значительное снижение уровня глутатиона (в 2.8 раза) в пищеварительной железе моллюска. Восстановленный глутатион, как известно, является одним из ключевых низкомолекулярных анти- оксидантов, вовлеченных в защиту клеточных биоструктур от окислительного повреждения. Наблюдаемое в этом исследовании снижение концентрации ГSH при аккумуляции меди может происходить из-за окисления ГSH до ГSSГ этим металлом [10, 16].

Возможно также, что уменьшение уровня ГSH при воздействии меди объясняется снижением активности ГР у C. grayanus . Снижение концентрации ГSH и активности ГР при воздействии меди также было найдено в пищеварительной железе и жабрах Mytilus galloprovincialis [33, 41]. Аналогичная реакция на медь была обнаружена в тканях пищеварительной железы и жабр пресноводного моллюска Unio tumidus [14].

Однако, несмотря на снижение активности антиоксидантных ферментов (СОД, КАТ, ГР) в клетках пищеварительной железы мидий C. grayanus при воздействии меди , уровень МДА также понизился. Известно, что низкомолекулярные белки металлотионеины, которые участвуют в детоксикации металлов, синтезируются в ответ не только на действие металлов [23], но и в ответ на стресс, такой как голодание [37]. В то же время показано, что эти белки участвуют в детоксикации оксирадикалов [40]. Вероятно, что наблюдаемое нами повышение показателя интегральной антирадикальной активности низкомолекулярных антиоксидантов (ИАА) и снижение уровня МДА при воздействии меди на фоне голодания можно объяснить синтезом этих защитных белков в пищеварительной железе моллюска.

Возможно также, что продукты анаэробного обмена играют определенную роль в антиоксидантной защите этих моллюсков при окислительном стрессе. Известно, например, что антиоксидантные свойства проявляет сукцинат - основной продукт анаэробиоза у мидий [20]. Кроме того, было показано, что воздействие ионов меди на молодых особей мидии Perna viridis приводит к увеличению содержания свободных аминокислот (гистидина, глутамата, глутамина, гипотаурина, диметилглицина, аргинина) в мягких тканях тела [42]. Вероятно, что повышенное содержание аминокислот в этих условиях поддерживает не только осморегуляцию, но и участвует в антиоксидантной защите клеток организма.

Снижение уровня продуктов перекисного окисления липидов (МДА и 4-гидроксиноне-наля) также было обнаружено в жабрах мидии Bathymodiolus azoricus при воздействии меди 25 мкг/л (24 ч) [11]. Однако, у устрицы Crassostrea virginica при воздействии меди (20 и 80 мкг/л в течение 7 дней) уровень МДА не изменился, что, по мнению авторов, является следствием адаптации этих моллюсков к характерным для них высоким уровням меди и цинка [12]. В то же время, воздействие меди 40 мкг/л (6 дней) приводит к увеличению содержания МДА в пищеварительной железе мидии M. galloprovincialis [41]. Было показано, что лизосомальная аутофагия поврежденных частей клеток и резервных продуктов в пищеварительной железе мидии M. galloprovincialis, вызванная отсутствием пищи, дает некоторую устойчивость к токсичности, вызванной воздействием меди [28]. Так авторы обнаружили, что при голодании дестабилизирующий эффект воздействия меди на мембраны лизосом был значительно меньше, чем в присутствии пищи.

Вероятно, и в случае с C. grayanus аутофагия, индуцированная как голоданием, так и действием меди на фоне голодания, способствовала формированию некоторой стресс-устойчивости моллюска к действию этих факторов. Видимо, поэтому, в наших экспериментах не происходит накопления продуктов перекисного окисления липидов (МДА).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные эксперименты показали, что при голодании, несмотря на ограниченность энергетических ресурсов, мидия Грея тратит внутриклеточные запасные вещества на поддержание высокого уровня ряда компонентов антиоксидантной системы (ферментов СОД и ГР, глутатиона). И, тем не менее, ограничение в доступности пищи приводит к снижению защитного антиоксидатного потенциала у данного вида моллюска (снижение активности КАТ, уровня ИАА), что необходимо учитывать при интерпретации результатов исследования влияния различных токсичных веществ на морских беспозвоночных в экспериментальных условиях.

Воздействие меди на фоне голодания приводит к значительному подавлению активности ферментов (СОД, КАТ, ГР) и снижению уровня ГSH. Слабое увеличение ИАА и отсутствие накопления МДА при действии меди в условиях голодания свидетельствует о присутствии у мидии Грея других достаточно развитых механизмов антиоксидантной защиты против повреждающих факторов среды, обладающих проокисли-тельным потенциалом.