Влияние способа хранения на функциональные параметры пыльцы свеклы столовой

Актуальной задачей при селекции на гетерозис двулетних овощных культур является ускорение создания линейного материала. Длительность селекционного процесса обусловлена отсутствием доступных и надежных методов отбора ценных генотипов на различных его этапах. В решении данного вопроса немаловажная роль отводится отбору на микрогаметофитном уровне. Микроскопические размеры пыльцы предоставляют возможность анализировать большой набор селекционного материала, а гаплоидное состояние генома, в отличие от диплоидного, позволяет обнаружить редкие рецессивные аллели [1]. Возможность проведения такого отбора основывается на значительной выраженности части спорофитного генома в гаплоидной фазе развития растения [2].

В результате исследований выявлены взаимосвязи между функциональными параметрами пыльцы свеклы столовой и проявлением признака ЦМС. Так, с увеличением степени стерильности инбредных растений I1-I2 уменьшаются диаметр и жизнеспособность фертильной пыльцы mf-цветков (r = -0,84 и r = -0,88 соответственно), снижается скорость роста пыльцевых трубок (r =-0,85) [3]. Учитывая существующие взаимосвязи, селекционер имеет возможность уже на стадии цветения выделять наиболее ценные генотипы для дальнейшей работы.

Известно, что препараты с проросшей пыльцой, зафиксированные дифференциальным красителем, можно хранить в течение нескольких месяцев, поскольку вещества, входящие в его состав, предохраняют препарат от высыхания, бактерий и грибов [4]. Это облегчает проведение полного анализа функциональных параметров пыльцы (жизнеспособность, длина и скорость роста пыльцевой трубки, стерильность) после окончания цветения. Однако при одновременном изучении большого количества исследуемых образцов и растений свеклы столовой актуальна проблема хранения пыльцы до момента ее проращивания на питательной среде и фиксации препаратов.

Известно, что прорастание пыльцы in vitro в большой степени зависит не только от генотипа, условий формирования, но и от условий хранения, которые способствуют как повышению жизнеспособности пыльцы, так и ее снижению [5, 6, 7]. То есть, важным условием при работе с пыльцой, является сохранение ее функциональных параметров в течение определенного времени, для чего необходимо создавать оптимальные условия, позволяющие сохранять жизне- и оплодотворяющую способность микрогаметофита. При массовом цветении растений расширяется временной интервал для проведения сравнительной оценки, что одновременно затруднительно из-за большого объема, а также для проведения скрещиваний между растениями, несовпадающими по времени цветения.

Рис. 1. Способы сбора и хранения пыльцы свеклы столовой:

А – свежесобранная в закрытом бюксе (1 вариант); Б – в цветках на веточке в бумажном пакете (2 вариант).

Fig. 1. Methods of collecting and storing pollen beet canteen:

A – fresh in eppendorf tube (option 1); B – in flowers on a twig in a paper bag (2 option).

Цель исследований – изучение влияния различных способов хранения пыльцы свеклы столовой на ее функциональные параметры при проращивании в условиях in vitro .

Материалы и методы

Материал исследований – пыльца фертильных растений инбредных потомств I1-I4 свеклы столовой, полученных на основе сортопопуляции Нежность.

Для изучения реакции микрогаметофита свеклы столовой на хранение при пониженной положительной температуре (10…12°С), пыльцу закладывали на хранение двумя способами: 1 – в закрытых бюксах, куда собирали пыльцу с раскрывшихся цветков; 2 – непосредственно в пыльниках, помещая

Таблица. Функциональные параметры микрогаметофита инбредных потомств свеклы столовой в контроле

(К) и после хранения (О) в течение семи суток при температуре 10...12 ° С в пыльниках (2 способ) Table. Functional parameters of microhametophyte of inbred offspring of beetroot in control

(K) and after storage (O) for seven days at a temperature of 10...12 ° C in anthers (2 method)

Селекционный номер	Жизнеспособность, %			Длина пыльцевой трубки, mkm
	К	О	отклонение от контроля	К	О	отклонение от контроля
490	15,7	13,5	-2,2	3,0	3,1	+0,1
527	21,2	17,3	-3,9	4,3	4,1	-0,2
458	25,5	25,4	-0,1	4,8	3,5	-1,3
523	29,9	27,2	-2,7	3,8	3,9	+0,1
492	36,9	28,7	-8,3	3,4	2,7	-0,8
529	46,0	38,3	-7,6	3,6	3,4	-0,2
НСР 05	4,7		1,2
ISSN 2618-7132 (online) научно-практический журнал			[ 52 ]	овощи россии №	4 (42) 2018 ISSN	2072-9146 (Print)

на третьи сутки хранения          на седьмые сутки хранения

Рис. 2. Прорастание пыльцы свеклы столовой in vitro (№ 529): перед закладкой на хранение (контроль); после хранения в бюксе (1 способ) и в пыльниках на веточках (2 способ) в течение трех и семи суток при температуре 10…12°С.

Fig. 2. Germination of beet pollen canteen in vitro (№529): before laying on the storage (control); after bucks storage (1 method) and in the anthers on the twigs (2 method) for three and seven days at a temperature of 10 ... 12°C.

небольшие цветущие веточки соцветия в бумажные пакеты, которые затем герметично упаковывали в полиэтиленовый пакет (рис. 1).

Перед закладкой на хранение (контроль) и после него проверяли уровень жизнеспособности пыльцы, проращивая ее in vitro в условиях влажной камеры [8] при температуре 24…25оС в течение двух часов на модифицированной питательной среде следующего состава (на 100 мл): ПЭГ-6000 – 25 г, сахароза – 15 г, H3BO3 – 5 мг, Са(NO 3 ) 2 .4H 2 O – 15 мг, рН 5,8-6,5.

Препараты с пыльцой после проращивания фиксировали дифференциальным красителем [9]. Микрофотосъемку проводили на микроскопе Micros с использованием цифровой камеры Canon A560. Подсчет проросших и лопнувших пыльцевых зерен, измерение длины пыльцевых трубок (Lpt) осуществляли с помощью программы «Scope Photo». Жизнеспособность (ЖСП) определяли как процент проросшей пыльцы от общего числа пыльцевых зерен в пробе; скорость роста пыльцевых трубок (Vpt) рассчитывали отношением средней длины пыльцевых трубок к временному интервалу проращивания. Объем выборки для подсчетов и измере- ний в одной повторности составлял 300-500 пыльцевых зерен (ПЗ), повторность – трехкратная. Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам [10].

Результаты и обсуждение

Способность пыльцы инбредных растений свеклы столовой прорастать при невысоких положительных температурах [11] дает основание предположить, что свежесобранная пыльца при хранении в схожих температурных условиях может долго оставаться жизнеспособной.

Однако у пыльцы, хранящейся в бюксах (1 способ), наблюдали быстрое снижение жизнеспособности – уже на вторые-третьи сутки этот параметр в зависимости от образца снижался в 3-10 раз относительно исходного значения свежесобранной пыльцы (контроль). На седьмые сутки наблюдалось очень слабое прорастание, пыльца слипалась в конгломераты, и существенно увеличивалось число лопнувших ПЗ во всех изученных образцах (рис.2). Процент лопнувших пыльцевых зерен в анализируемой пробе является важной характеристикой состояния пыльцевой популяции, который с одной стороны связан с разнокачественностью ПЗ по степени зре-

Рис. 3. Доля лопнувших ПЗ (%): исходно (контроль);

после недельного хранения в пыльниках при 10 ° С (опыт).

Fig. 3. Share of burst pollen grain (%):

initial (control); after a week of storage in anthers at 10 ° C (experience).

Рис.4. Зависимость между ЖСП пыльцы до и после недельного хранения в пыльниках при 10...12 ° С.

Fig. 4. The relationship between the germination of pollen before and after storage in anthers at 10-12 ° C.

Рис.5. Скорость роста пыльцевых трубок (mkm/час): исходно (контроль); после недельного хранения (опыт) при 10 ° С в пыльниках.

Fig. 5. Growth rate of pollen tubes (mkm/h): initial (control); after a week of storage (experience) at 10°C in anthers.

лости, а с другой – является результатом их реакции на внешнее воздействие, в том числе и на условия хранения.

Доля лопнувших ПЗ, после недельного хранения в пыльниках цветков на веточках (2 способ), у одних образцов снижалась относительно контроля, у других, наоборот, увеличивалась (рис. 3). Возможно, это связано с разнонаправленными процессами «дозаривания» в бутонах и «старения» ПЗ в уже раскрывшихся цветках, которые в отдельных пыльниках разных инбредных растений протекают с разной скоростью. Но в целом, при хранении в пыльниках, пыльца более длительное время сохраняла способность к прорастанию на достаточно высоком уровне (рис. 2).

На седьмые-восьмые сутки хранения жизнеспособность пыльцы разных генотипов снижалась на 0,1-8,3%, при этом характер распределения образцов по уровню жизнеспособности сохранялся (табл.). Используя уравнение линейной зависимости между значениями показателей до и после хранения, можно с высокой вероятностью (R2=0,94) определить близкий к исходному уровень жизнеспособности микрогаметофита после недельного выдерживания собранных веточек в холодильнике (рис. 4). Это имеет важное значение при работе с большим набором образцов, когда нет возможности провести их сравнительный анализ единовременно.

При анализе изменения длины пыльцевых трубок такой тесной зависимости не отмечено (R2=0,33), и скорость роста трубки у большинства образцов после хранения оставалась практически на уровне контрольной, кроме образцов 492 и 458 с депрессией по обоим показателям (Lpt и Vpt) около 25% (табл.; рис.5).

Следует отметить, что после длительного хранения веточек для проведения анализа лучше брать пыльцу с выполненных пыльников крупных бутонов, в которых уже завершился процесс спорогенеза, и пыльца готова к прорастанию. Это связано с тем, что в цветках, раскрывшихся до закладки на хранение, резко снижается активность гидролитических ферментов, ответственных за прорастание и начинаются процессы старения ПЗ [12].

Таким образом, для сравнительного анализа жизнеспособности пыльцы инбредных растений свеклы столовой при оценке большого набора образцов рекомендуется хранение цветущих веточек в бумажных пакетах при пониженной температуре (10...12°С). Данный способ хранения позволяет сохранить жизне- и оплодотворяющую способность микрогаметофита в течение семи-восьми суток. Такая необходимость часто возникает на первых этапах создания ms- и mf-линий для селекции на гетерозис, когда проводится инбридинг большого числа растений свеклы столовой.

• • Литература

  • 1.    Hormaza J.I., Herrero M. Pollen selection // Theor. Appl Genet., 1992. – Vol 83. – P.663-672.

  • 2.    Ottaviano E., Mulcahy D.L. Genetics of angiosperm pollen // Advances in genetics, 1989. – Vol.2. – P.61-64.

  • 3.    Ветрова С.А. Исходный материал для селекции на гетерозис свеклы столовой / Автореф. дисс… канд. с.-х. наук: 06.01.05. Москва, 2011. – 24 с.

  • 4.    Бунин М.С., Шмыкова Н.А., Бочарникова Н.И., Пышная О.Н., Джос Е.А. Методические рекомендации по определению жизнеспособности пыльцы рода Capsikum annuum L. – Москва. – 2004. – С.9.

  • 5.    Методические указания по гаметной селекции сельскохозяйственных растений (методология, результаты и перспективы) / под ред. Пивоварова В.Ф. М. 2001. – 390с.

  • 6.    Козарь Е.Г., Беспалько Л.В.; Балашова Н.Н.; Балашова И.Т.; Пышная О.Н., Енгалычева И.А. Влияние условий хранения на жизнеспособность пыльцы перца сладкого // Материалы международной научно-практической конференции "Инновационные технологии в селекции и семеноводстве с.-х. культур" посвященной 125-летию С.И. Жегалова. М: ВНИИССОК. – 2006. – Т.2. – С.139-145.

  • 7.    Жужжалова Т.П. Эмбриология сахарной свеклы. Развитие мужского гаметофита / Энциклопедия рода Beta: биология, генетика, селекция свеклы /отв. ред. Малецкий С.И. –Новосибирск. –2010. – С.87-93.

  • 8.    Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. – 271 с.

  • 9.    Данвелл Д.М. Культура гаплоидных клеток // Биотехнология растений: культура клеток / Пер. с анг. под ред. Р. Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1989. – С.33-51.

  • 10.    Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М: Агропромиздат, 1985. – 351 с.

  • 11.    Козарь Е.Г., Заячковский В.А., Федорова М.И., Балашова И.Т. Влияние температуры на прорастание пыльцы свеклы столовой в условиях in vitro // Научный аль-манах:сельскохозяйственные науки. – Тамбов. – 2015. – №11(4/13). – С.322-327.

  • 12.    Brewbaker J. L., Kwack B. H. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube grоwth //American Journal of Botany. – 1963. – V.50. – P.239-263.

• • References

  • 1.    Hormaza J.I., Herrero M. Pollen selection // Theor. Appl Genet., 1992. Vol 83. P.663-672.

  • 2.    Ottaviano E., Mulcahy D.L. Genetics of angiosperm pollen // Advances in genetics, 1989. Vol.2. P. 61-64.

  • 3.    Vetrova S.A. Source material for breeding for heterosis beetroot / Avtoref. Diss.... kand. of agricultural Sciences: 06.01.05. Moscow, 2011. 158 p.

  • 4.    Bunin M.S., Shmykova N.A., Bocharnikova N.I., Pyshnaya O.N., Dzhos Y.A. Methodical recommendations on determination of germination pollen of the Capsikum annuum L. Moscow. 2004. P.9.

  • 5.    Methodological guidelines for gametes breeding of agricultural plants (methodology, results and perspectives) / ed. Pivovarov V.F. M.2001. 390p.

  • 6.    Kozar E.G., Bespalko L.V.; Balashova N.N., Balashova I.T., Pyshnaya O.N., Engalycheva I.A. Influence of storage conditions on germination of pollen of Capsikum annuum L. // Materials of international scientific-practical conference "Innovative technologies in plant breeding and seed growing of agricultural cultures" devoted to 125th anniversary of S.I. Zhegalov. M: VNIISSOK. 2006. T.2. P.139-145.

  • 7.    Zhuzhzhalova T.P. Embryology of sugar beet. The development of microgametophyte / Encyclopedia of the genus Beta: biology, genetics, breeding beets /resp. edited by Maletskii S.I. –Novosibirsk. 2010. P.87-93.

  • 8.    Pausheva Z.P. Practicum on plant Cytology. Moscow: Agropromizdat, 1988. 271 p.

  • 9.    Danvell D.M. Culture of haploid cells // Plant Biotechnology: cell culture / English. edited By R. G. Butenko. Moscow: Agropromizdat, 1989. P.33-51.

  • 10.    Dospehov B.A. Methodology of field experience (with the basics of statistical processing of research results). M: Agropromizdat, 1985. 351 p.

  • 11.    Kozar E.G., Zayachkovskiy V.A., Fedorova M.I., Balashova I.T., The Influence of temperature on the germination of pollen beetroot in vitro // Science almanac: agricultural science. Tambov. 2015. No.11(4/13). P.322-327.

  • 12.    Brewbaker J.L., Kwack B.H. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube grоwth //American Journal of Botany. 1963. V.50. P.239-263.

I 54 ]